RAGE在間歇缺氧致動脈粥樣硬化作用中的體外研究.pdf

1、背景和目的：
　　阻塞性呼吸睡眠暫停低通氣綜合征（OSAHS）的主要臨床特征是睡眠狀態(tài)下的間歇缺氧(IH)，也是導(dǎo)致包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的很多心血管疾病的獨(dú)立危險因素。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn) OSAHS病人外周血單核細(xì)胞 RAGE含量明顯高于正常人，持續(xù)正壓通氣治療能減少病人外周血單核細(xì)胞RAGE表達(dá)。OSAHS致動脈粥樣硬化的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前研究表明RAGE/AGEs配體系統(tǒng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。為了探

2、討 RAGE/AGEs在OSAHS致動脈粥樣硬化中的作用，本實(shí)驗(yàn)擬使用THP-1（人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞）模擬IH導(dǎo)致動脈粥樣硬化的體外細(xì)胞模型，使用RNA干擾法沉默THP-1細(xì)胞的RAGE基因表達(dá)，檢測其對IH條件下的THP-1細(xì)胞單核細(xì)胞趨化、巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化、泡沫細(xì)胞細(xì)胞形成等的影響。
　　方法：
　　1.首先檢測THP-1細(xì)胞在IH0h、12h、24h、48h后RAGE、NF-kB p65、AGEs表達(dá)量。
　　2.

3、然后使用靶向RAGE的shRNA構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，并篩選出沉默RAGE效率最高的穩(wěn)定細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為四組：空白對照組：正常培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)對照組A：RAGE（-/-）+正常培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)對照組B：IH培養(yǎng)。D：實(shí)驗(yàn)組：RAGE（-/-）+IH培養(yǎng)。
　　3.THP-1細(xì)胞及沉默RAGE的THP-1細(xì)胞按上述分組處理，24小時后比較四實(shí)驗(yàn)組間單核細(xì)胞聚集指標(biāo)MCP-1、CCR2，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化指標(biāo)CD14、CD68表達(dá)

4、量差異。
　　4. THP-1細(xì)胞及沉默RAGE的THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA（100ng/ml）誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)分化所得 THP-1細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞按上述實(shí)驗(yàn)分組，并在培養(yǎng)基中加入終濃度為50ug/ml ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞化，24小時后油紅O染色評估四組間泡沫細(xì)胞形成差異。
　　結(jié)果：
　　1.IH處理后，THP-1細(xì)胞RAGE、NF-kB p65表達(dá)經(jīng)WB驗(yàn)證在一定范圍內(nèi)隨時間呈遞增趨勢，RAGE在

5、 IH后24小時表達(dá)量達(dá)高峰（RAGE/GAPDH1.043±0.10），并可持續(xù)至IH48小時（RAGE/GAPDH1.289±0.18，P＜0.05）， NF-kB p65在IH12小時后表達(dá)量達(dá)高峰（NF-kB p65/GAPDH0.30±0.04，P＜0.05），可持續(xù)至IH24小時（NF-kB p65/GAPDH0.32±0.03，P＜0.05），并于IH后48小時（NF-kB p65/GAPDH0.21±0.03，P＜0.0

6、5）開始降低。上清液中AGEs48小時內(nèi)表達(dá)量隨IH時間的增加而增加（P＜0.05）。
　　2.單核細(xì)胞趨化指標(biāo)MCP-1、CCR2，與空白對照組相比，IH培養(yǎng)組THP-1細(xì)胞MCP-1、CCR2表達(dá)量增加（P＜0.05）；與IH培養(yǎng)比較，RAGE（-/-）+IH培養(yǎng)組THP-1細(xì)胞MCP-1、CCR2表達(dá)量減少（P＜0.05）。
　　3.巨噬細(xì)胞分化指標(biāo)CD14、CD68，與空白對照組相比，IH培養(yǎng)組THP-1細(xì)胞 CD1

7、4、CD68表達(dá)量增加（P＜0.05）；與 IH培養(yǎng)比較，RAGE（-/-）+IH培養(yǎng)組THP-1細(xì)胞CD14、CD68表達(dá)量減少（P＜0.05）。
　　4、IH可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞生成，沉默RAGE基因可以抑制IH導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞泡沫化。
　　結(jié)論：
　　1. THP-1細(xì)胞RAGE、NF-kB p65、AGEs的表達(dá)量在一定時間范圍內(nèi)隨IH時間的增加而增加。
　　2. RAGE可以促進(jìn)IH導(dǎo)致的THP-1細(xì)