可示蹤的防齲基因疫苗構建、表達及其基因疫苗PELA微球的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究將微生物學、免疫學、分子生物學和生物材料學等多學科有機結合起來,運用基因重組技術構建了可示蹤的防齲基因疫苗;對可生物降解材料作為防齲基因疫苗釋放系統(tǒng)進行了研究;并對防齲基因疫苗在體內外的表達以及不同方式免疫的BALB/C小鼠的特異性抗體進行了檢測.通過GFP的指示作用及免疫組化方法,對防齲基因疫苗在體內外的表達進行初步的示蹤研究,為防齲基因疫苗的臨床應用奠定基礎.該研究共包括四個部分.第一,該研究構建了以綠熒光蛋白基因作為報告基因

2、的可示蹤的防齲基因疫苗.利用PCR方法,擴增變異鏈球菌(Streptococci mutans,S.mutans)MT8148菌株表面蛋白抗原PAC氨基端的基因片段pac-A(1.3Kb).PCR產物與真核表達質粒pEGFP-C1雙酶切,并回收相應DNA片段后,采用DNA連接試劑盒進行連接重組,轉化.轉化子中的重組質粒經雙酶切鑒定,獲得了4.7Kb與1.3Kb兩個片段;重組質粒中插入基因的序列測定表明,該插入序列與pac全基因的314-

3、1630bP的核酸序列完全相同,插入基因的兩側分別與Kpn I和Apa I酶切位點的序列一致,插入基因的上游有起始密碼子,下游有終止密碼子.第二,為了檢測構建的可示蹤的防齲基因疫苗能否在哺乳動物細胞中正確表達出來,將構建正確的重組質粒pEGFPC1-pacA采用脂質體Lipofectin試劑介導轉染COS1細胞.通過熒光倒置顯微鏡直接觀察和流式細胞儀測定熒光強度指示GFP的表達;采用RT-PCR法檢測重組質粒中pac-A基因在COS1細

4、胞中的轉錄;并用蛋白質免疫印跡雜交(Western blot)檢測轉染細胞上清液pac-A基因的表達.第三,該實驗旨在為防齲基因疫苗尋找一種有效的釋放系統(tǒng).以聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)為材料,采用改進的溶劑揮發(fā)法雙乳液(W1/O/W2)體系制備DNA/PELA復合物,在掃描電鏡下觀察其形態(tài)、粒度分布儀測定平均粒徑;測定了復合物中DNA的包封率、細胞外釋放特征,及其包被對DNA結構的影響;采用MTT法測定了PELA包被材料本身的細

5、胞毒性;并對其介導的DNA體外轉染真核細胞的效果進行了檢測.結果顯示所制備的復合物多為球形,平均粒徑1.806μm;微球中DNA的包封率達78.9﹪,在細胞外具有緩釋的特征,DNA結構沒有被破壞;PELA材料本身對細胞基本無毒性;DNA/PELA微球能在體外直接轉染COS1細胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察到了發(fā)綠色熒光的被轉染細胞;流式細胞儀測定重組質粒DNA/PELA微球細胞組的平均熒光強度比陰性對照細胞組的高,但比陽性對照細胞組低;用R

6、T-PCR檢測重組質粒陽性對照組及DNA/PELA轉染組的pac-A基因的轉錄.第四,為了進一步證實構建的可示蹤防齲基因疫苗的免疫學活性,以及PELA基因疫苗釋放系統(tǒng)對免疫效果的影響,我們進行了小鼠體內實驗.將基因疫苗裸DNA和DNA/PELA微球分別以單劑肌注,多次肌注,口服接種等方式對BALB/C小鼠進行免疫,通過ELISA法檢測血清特異性抗體.該實驗還通過GFP的指示作用及免疫組化法對基因疫苗在實驗小鼠體內各組織的分布進行了示蹤研

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