HIV-1 Nef基因的克隆、表達(dá)及其核酸疫苗的實(shí)驗(yàn)免疫研究.pdf

1、艾滋病病毒l型(HIV-1)屬于單股正鏈核糖核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒因具有高突變率、高重組率和高復(fù)制率等特點(diǎn)，故其基因組能快速變異，產(chǎn)生大量變異株，從而順利逃脫宿主的免疫壓力，致使HIV感染者/艾滋病(HIV/AIDS)患者總數(shù)日趨增多。
　　 Nef（負(fù)因子）是一種N-末端豆蔻酰化蛋白質(zhì)。盡管Nef對(duì)于病毒的體外復(fù)制是非必需的，但它在HIV-1體內(nèi)致病中發(fā)揮作用。自從nef基兇被成功克隆后，數(shù)以千計(jì)的關(guān)于Nef功能的論

2、文已發(fā)表，這些發(fā)現(xiàn)確定了Nef的四個(gè)主要功能：(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面分子的表達(dá)量，(2)增強(qiáng)病毒感染力，(3)干擾細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，(4)操控細(xì)胞凋亡機(jī)制。雖然這些發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)相關(guān)性有待于進(jìn)一步確認(rèn)，但它提示了Nef的體外功能和HIV-I在體內(nèi)致病性之間的相關(guān)性。
　　 在多種病毒性疾病的動(dòng)物模型上已經(jīng)證實(shí)核酸疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)牛體液和細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。核酸疫苗的興起和發(fā)展為HIV的防治提供了新的途徑。核酸疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞及體

3、液免疫反應(yīng)，特別是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力優(yōu)于蛋白、多肽類疫苗。
　　 核酸疫苗的免疫效果在不同動(dòng)物個(gè)體中差異較大，某些腫瘤及病毒的T、B細(xì)胞表位抗原性弱，難以誘導(dǎo)有效的T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高核酸痰苗的免疫效果已成為研究熱點(diǎn)?；蜃魟┦菍⒕幋a某些細(xì)胞網(wǎng)子及T、B細(xì)胞表面共刺激分子等的基因與目的基因克隆于同一載體或不同載體共同免疫動(dòng)物，其表達(dá)的相應(yīng)蛋白可起到佐劑的作用，從而大大增強(qiáng)T、B細(xì)胞的免疫應(yīng)答水平。
　　 LIGH

4、T是TNF配體家族的成員，可以共刺激T細(xì)胞增殖。HVEM是LIGHT介導(dǎo)T細(xì)胞活化的受體，LIGHT通過與HVEM結(jié)合發(fā)揮共刺激作用，參與T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。越來越多的證據(jù)表明LIGHT與其受體的相互作用可作為控制細(xì)胞免疫應(yīng)答的潛在目標(biāo)。
　　 基于Nef在HIV感染中的罩要作用，以nef作為靶基因制備HIV核酸疫苗，并研究其免疫效果具有重要意義。本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建含有nef基因的高效原核表達(dá)載體pET24-Ne

5、f,并在大腸桿菌BL21中表達(dá)高效HIV-1Nef蛋白；利用Nef蛋白免疫家兔，得到高效價(jià)兔抗HIV-1nef血清；將全長nef基因插入pcDNA3.1(+)載體巾構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Nef,體外轉(zhuǎn)染檢測(cè)結(jié)果表明真核表達(dá)質(zhì)粒中的nef基因可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；將nef核酸疫苗質(zhì)粒單獨(dú)或與LIGHT真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫Balb/c小鼠，細(xì)胞免疫與體液免疫功能檢測(cè)結(jié)果表明nef核酸疫苗可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，LIGHT