口服KISS1基因疫苗構(gòu)建及其對綿羊生殖軸的影響.pdf

1、手術(shù)去勢能夠顯著提高公畜的脂肪沉積并使其變得溫順。因此幾個世紀(jì)以來廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。雖然手術(shù)去勢能夠徹底去除公畜的生殖能力，但是普遍有著技術(shù)要求高和術(shù)后容易感染等缺點(diǎn)，即使進(jìn)行麻醉動物應(yīng)激反應(yīng)依然較大，使得短期內(nèi)公畜的生長性能下降。后來，科學(xué)家開始尋找替代手術(shù)去勢的方法，從而開發(fā)出免疫去勢。基于GnRH基因疫苗能夠誘導(dǎo)表達(dá)GnRH抗體，通過降低體內(nèi)GnRH水平而降低血清睪酮水平，抑制性行為。KISS-1基因產(chǎn)物kisspeptin通過

2、與G蛋白偶聯(lián)受體（GPR-54）之間的互作，激活下丘腦中GnRH神經(jīng)元，控制GnRH的合成與分泌，進(jìn)而促進(jìn)促性腺激素（LH和FSH）的分泌，在調(diào)節(jié)動物發(fā)情期和生殖活動上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Kisspeptin和GPR-54是控制青春期的重要上游調(diào)節(jié)因子。促性腺激素釋放激素(GnRH)是促性腺激素的中樞調(diào)節(jié)因子，能夠通過刺激GnRH釋放促進(jìn)性腺的發(fā)育和功能。在哺乳動物中，干擾該信號通路能夠引起低促性腺激素性性腺機(jī)能減退。本研究分析口服k

3、isspeptin重組基因疫苗對羔羊生殖生理和行為的作用，評估活性kisspeptin DNA疫苗口服免疫對激素受體mRNA和蛋白表達(dá)的有效性。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)建C500/pKS-asd真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　將本課題組構(gòu)建的PV AX-KISS-1-S-asd質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒豬霍亂沙門氏菌C500中，經(jīng)測序和酶切鑒定挑選陽性克隆，命名為C500/pKS-asd重組菌，在無菌培養(yǎng)基中連續(xù)接種50代，提取質(zhì)粒以及細(xì)

4、菌基因組DNA，用雙酶切和沙門氏菌屬中保守InvA基因序列的PCR擴(kuò)增鑒定重組真核表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的傳代穩(wěn)定性。將菌株C500/pKS-asd和C500/pVAX-asd分別用50μL/mg二氨基庚二酸(DAP)接種到LB肉湯，并在650nm(OD650)處以0.5的光密度下過夜。4℃、12，000rpm離心10分鐘收集細(xì)菌。在接種到羔羊之前，通過將接種物稀釋到LB瓊脂上來證實(shí)微生物的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)，將細(xì)菌細(xì)胞調(diào)節(jié)至5×1010CFU/m

5、l劑量。離心后將細(xì)菌細(xì)胞重新懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進(jìn)行疫苗接種。
　　(2)Kisspeptin基因疫苗口服免疫的去勢效果
　　將10只56日齡的羔羊隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，分別接種實(shí)驗(yàn)重組疫苗C500/pKS-asd或C500/pVAX-asd。接種方式為口服給藥，并且在初次免疫后的第28天和第56天重復(fù)相同的處理。在初免后的第0天，第14天，第28天，第42天，第56天，第70天和第84天測定陰囊周長并采血。于

6、接種的第98天評估性行為，測量陰囊周長并收集血液樣本。實(shí)驗(yàn)組羊羔的陰囊周長(19.82±3.18cm)顯著低于免疫后第42-98天對照組(22.16±4.79cm)(P＜0.05)，睪丸重量顯著低于對照組(91.83±1.429VS118.10±7.29g，P＜0.01)，睪丸長度也顯著低于對照組(6.64±0.11cm VS7.40±0.29，P＜0.05)。與對照組動物相比，實(shí)驗(yàn)組公羊曲細(xì)精管管腔內(nèi)的精原細(xì)胞和精子產(chǎn)生量明顯少于對照

7、組，并且性行為顯著降低(P＜0.01)。這些數(shù)據(jù)表明，kisspeptin疫苗的口服免疫能夠抑制羔羊的性腺功能和性行為。
　　(3)Kisspeptin基因疫苗口服免疫后的KISS-1抗體和血清睪酮水平。
　　通過間接ELISA測量血清中抗kisspeptin-54抗體和睪酮水平。在免疫后第42天至實(shí)驗(yàn)期（第98天）結(jié)束時，試驗(yàn)組羔羊中檢測到kisspeptin-54抗體。結(jié)果表明，與對照組相比，試驗(yàn)組kisspeptin-

8、54抗體水平顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，而血清睪酮水平顯著降低(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，口服Kisspeptin疫苗可以誘導(dǎo)抗體并降低睪酮濃度水平，實(shí)現(xiàn)免疫去勢。
　　(4)Kisspeptin口服免疫對下丘腦-垂體性腺軸中激素受體mRNA表達(dá)的影響
　　取對照組和試驗(yàn)組的睪丸，下丘腦和垂體組織樣。用TRIzol試劑從樣品中提取總RNA，用定量實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR)來測定下丘腦內(nèi)KISS1、GPR-5

9、4和促性腺激素釋放激素(GnRH)mRNA的水平(P＜0.01，P＜0.05)，垂體中黃體生成激素β(LHβ)、卵泡刺激素β(FSHβ)和促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)的mRNA水平睪丸內(nèi)黃體生成激素受體(LHR)和促卵泡激素受體(FSHR)的mRNA水平。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組睪丸FSHR和LHRmRNA水平顯著降低(P＜0.01).下丘腦.kissipeptin、GPR54和GnRH mRNA水平明顯低于對照組(P＜0.01，P

10、＜0.05)。此外，去勢免疫組LHβ，F(xiàn)SHβ，GnRHR mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05，P＜0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，口服Kisspeptin基因疫苗可影響下丘腦-垂體性腺軸激素受體mRNA的表達(dá)水平。
　　(5)口服Kisspeptin疫苗接種對活重的影響
　　實(shí)驗(yàn)組動物體重與對照組動物體重?zé)o顯著差異，說明口服kisspeptin基因免疫不影響動物生長。
　　綜上所述，kisspeptin基因重組口服疫苗能