PDX1在胃癌中的作用及啟動(dòng)子CpG島甲基化與PDX1表達(dá)下調(diào)的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的： 同源異型基因(homeobox genes)是一類包含同源框即183個(gè)氨基酸序列(homeobox)的調(diào)節(jié)基因，能夠編碼有轉(zhuǎn)錄因子功能的同源異型蛋白(homeoproteins)。同源異型基因?qū)τ谂咛ブ鸺?jí)分化并維持自身在成年組織的表達(dá)模式有著重要作用。有些在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的同源異型基因可能在胚胎發(fā)育中和未分化細(xì)胞中正常表達(dá)；相反，有些在腫瘤中表達(dá)下調(diào)的同源異型基因可能在成年和／或分化細(xì)胞中正常表達(dá)。目前認(rèn)為同源

2、異型基因可能是正向或者負(fù)向腫瘤調(diào)節(jié)者，參與癌發(fā)生的過程。例如，CDX1和CDX2在結(jié)腸中表達(dá)缺失，但卻普遍表達(dá)于腸化組織和胃腫瘤中，與胃癌發(fā)生過程中腸分化有關(guān)。 PDX1即胰十二指腸同源異型基因(pancreatic duodenal homeobox1)，編碼胰十二指腸同源框蛋白1，又稱IPF-1、IDX-1、IUF-1。PDX1屬于ParaHox家族轉(zhuǎn)錄因子的一員，位于染色體13q12.1上，鄰近于CDX2。已知PDX1在胰

3、腺，十二指腸及胃竇的發(fā)育分化過程中起著重要作用。目前已知PDX1基因在遠(yuǎn)端胃的內(nèi)分泌細(xì)胞中有表達(dá)，其異常表達(dá)可能與胃的病理過程如胃粘膜萎縮和化生有關(guān)。但PDX1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能尚不明了。由此我們假設(shè)PDX1可能是胃癌發(fā)生發(fā)展中的潛在腫瘤調(diào)節(jié)因子。 本部分研究中，我們旨在闡明PDX1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)模式，通過體內(nèi)外研究揭示PDX1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能和作用。 材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

4、7株人胃癌細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection和取自香港瑪麗醫(yī)院內(nèi)科系實(shí)驗(yàn)室；人胃癌組織標(biāo)本取自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院；雌性BALB／c-nu／nu裸鼠購(gòu)自香港大學(xué)動(dòng)物中心。 結(jié)果： 1.PDX1在胃癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào)或缺失7株胃癌細(xì)胞N87、SGC7901、AGS、BCG823、KATOⅢ、 MKN45、SNU1僅有低表達(dá)或不表達(dá)PDX1；PDX1正常表達(dá)于慢性胃炎及癌旁正常組

5、織，但在74％(29／39例)的胃癌組織檢測(cè)不到(p<0.05)；PDX1 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(p<0.05)。 　　2.PDX1和Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)免疫組化顯示Ki-67蛋白表達(dá)水平在癌旁組織和胃癌組織中逐漸升高，而相應(yīng)地PDX1表達(dá)水平而逐漸下降，兩者有一定負(fù)相關(guān)(r=-0.771，p<0.05)。 3.PDX1過表達(dá)抑制人胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡與空質(zhì)粒對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染PDX1的胃癌細(xì)胞增殖指數(shù)

6、顯著下降，同時(shí)凋亡指數(shù)明顯升高(p<0.05)；此外Ki-67表達(dá)水平升高，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9和caspase-10的活性則被激活。 4.PDX1過表達(dá)抑制人胃癌細(xì)胞克隆形成，傷口愈合和遷移等能力與空質(zhì)粒對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染PDX1的胃癌細(xì)胞形成的單細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少(82±14 × 103 vs 257±67 × 103，p<0.05)；其愈合傷口的速度明顯延緩，6h， 12h，2

7、4h時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合率顯著降低(10％±0 vs 46.67％±3.33％，21.67％±4.41％ vs76.67％±3.33％，66.67％±8.82％ vs 93.33％±3.33％，p<0.05)；細(xì)胞遷移能力亦明顯受到抑制0(0.060±0.001 vs 0.274±0.068，p<0.05)。 5.PDX1穩(wěn)定過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力接種了SGC-PDX1.6細(xì)胞的裸鼠形成的移植瘤全部消失，而接種SGC-pc

8、DNA細(xì)胞的裸鼠僅有一個(gè)瘤體消失；接種了AGS-PDX1細(xì)胞的裸鼠形成的移植瘤體積明顯小于對(duì)照組(51.6±19.5 mm3 vs 125.7±16.3 mm3，p<0.05)。 結(jié)論： 1.PDX1在胃癌中是一個(gè)抑癌基因； 2.PDX1在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)甚至缺失； 3.PDX1與Ki-67在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)向關(guān)系； 4.體外PDX1瞬時(shí)過表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡；

9、 5.體外PDX1穩(wěn)定過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞克隆形成、傷口愈合及遷移能力； 6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明PDX1穩(wěn)定過表達(dá)抑制了裸鼠移植瘤的形成和生長(zhǎng)． 胃癌研究背景和目的DNA甲基化是一類不改變DNA序列且能遺傳下去的化學(xué)修飾。已知啟動(dòng)子CpG島的DNA甲基化能抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。目前明確的是啟動(dòng)子CpG島胞嘧啶甲基化與基因沉默以及癌發(fā)生有關(guān)。例如PALB2、，DFNA5、NPTX2、，p16、p19、，9p21基因往往都存在CpG

10、島甲基化。 近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)CpG島的甲基化，尤其啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化與同源異型基因的功能沉默有關(guān)。多個(gè)研究報(bào)道HOXA10、HoxA5和HoxB5、HOXD1、HOXA9和HOXB5、ALX4、PROX1基因存在異常的DNA甲基化，從而引起這些基因表達(dá)下調(diào)或缺失。另外ParaHox家族的腸特異性同源異型基因CDX1和CDX2亦存在啟動(dòng)子CpG島甲基化，且與二者在結(jié)腸癌，食道癌以及胃癌中的表達(dá)下降有關(guān)。 我們第一部分研究證實(shí)

11、了PDX1是一新的抑癌基因，在胃癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)明顯下調(diào)，能夠抑制胃癌的增殖生長(zhǎng)，克隆形成，細(xì)胞遷移等能力。但是PDX1在胃癌中表達(dá)缺失是否與其啟動(dòng)子CpG島甲基化有關(guān)尚未明了。 本研究旨在確定PDX1可能的啟動(dòng)子區(qū)域，以及分析CpG島在啟動(dòng)子區(qū)域的分布情況及評(píng)價(jià)CpG島在胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中的甲基化狀態(tài)，闡明PDX1基因在胃癌中的表達(dá)變化與啟動(dòng)子CpG島甲基化的關(guān)系。 結(jié)果： 1.5’-AZA去甲基化促進(jìn)

12、PDX1基因在人胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)與對(duì)照比較，經(jīng)過5'-AZA去甲基化處理后的胃癌細(xì)胞(AGS，BCG823，SGC7901，TMK1，SNU1，MKN45)內(nèi)PDX1 mRNA得到重新表達(dá)。而且5'-AZA去甲基化處理后的AGS和／或SGC7901表達(dá)的PDX1 mRNA有一定的劑量依賴性及時(shí)間依賴性。 2.PDX1啟動(dòng)子報(bào)告基因活性檢測(cè)與空載體pGL3-basic轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，F(xiàn)383-I1和F314-I2兩段報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)

13、染的細(xì)胞均有PDX1啟動(dòng)子活性，但F383-I1表現(xiàn)出最強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，有最高的Firefly Luc／Renilla Luc比值。F283-I3和F724-I4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則未表現(xiàn)出啟動(dòng)子活性。另外，與未處理的F383-I1比較，經(jīng)過Sss I甲基化酶和5'-AZA去甲基化藥物處理的F383-I1的Firefly Lux／Renilla Luc比值明顯降低和升高(p<0.05)。 　　3.人胃癌細(xì)胞株P(guān)DX1啟動(dòng)子CpG島呈高度甲基化

14、狀態(tài)的MSP分析PDX1四個(gè)CpG島在6株細(xì)胞(AGS、BCG823、SGC7901、MKN45、TMK1、SNU1)中均有完全甲基化或部分甲基化。 4.人胃癌細(xì)胞株CpG-I1甲基化狀態(tài)的BSP分析6株人胃癌細(xì)胞(AGS、BCG823、SGC7901、MKN45、TMK1、SNU1)均表現(xiàn)出高度的的CpG-I1甲基化率(77.5％±4.4％、97.1％±1.9％、82.4％±5.9％、88.2％±5.3％、81.8％±2.8％

15、、97.1％±1.3％)；而兩例對(duì)照癌旁正常組織的CpG-I1甲基化率僅為1.9％±1.2％、1.0％±1.0％。 5.人胃癌組織CpG-I1甲基化MSP分析30例胃癌組織全部有CpG-I1甲基化(3例(10％)完全甲基化，27例(90％)部分甲基化)，而癌旁正常組織則有16例(53.33％)無(wú)甲基化，其余14例(46.67％)表現(xiàn)部分甲基化。 結(jié)論： 1.啟動(dòng)子CpG島甲基化與PDXl基因在胃癌的表達(dá)下調(diào)相關(guān)；