綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與綿羊支原體肺炎相關(guān)性研究.pdf

1、甘露糖結(jié)合凝集素（mannose- binding lectin, MBL）是一種由肝臟合成和分泌的急性期蛋白，屬于膠原凝集素家族，廣泛存在于肝臟及血液中。MBL 通過激活補(bǔ)體和調(diào)理吞噬作用在抗感染的起始階段起主導(dǎo)作用，是一種重要的天然免疫防御分子。本試驗(yàn)從羊MBL基因序列入手，結(jié)合綿羊肺炎支原體感染情況，探討MBL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與綿羊支原體肺炎的相關(guān)性，為進(jìn)一步診斷與治療綿羊支原體性肺炎的提供重要的理論依據(jù)，為優(yōu)良品種的選育提供科

2、學(xué)參考。一、綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆及序列分析為了得到綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)序列，本研究參照本實(shí)驗(yàn)室向NCBI提交的綿羊MBL基因序列（GenBank: FJ977629.1），設(shè)計(jì)3對特異性引物，以綿羊基因組DNA為模板，采用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到一特異性片段，經(jīng)回收重組到pMD18-T載體，篩選陽性克隆，測序。結(jié)果如下：所測序列長為679 bp，并通過生物軟件和權(quán)威在線預(yù)測網(wǎng)站對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比對，發(fā)現(xiàn)所獲得序列內(nèi)含DEF

3、、Ets、GAGA-1、TCF/LEF和Otc-3等多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件和結(jié)合位點(diǎn)，本試驗(yàn)所得綿羊MBL基因啟動(dòng)子是1個(gè)無TATA-box但有Ets和DPE且能正常轉(zhuǎn)錄的真核啟動(dòng)子，實(shí)驗(yàn)成功獲得了綿羊MBL基因的啟動(dòng)子區(qū)序列。二、綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測方法的建立表觀修飾是一類高于基因水平的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，DNA甲基化作為表觀修飾的核心內(nèi)容，一直是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。DNA甲基化是脊椎動(dòng)物DNA唯一的自然化學(xué)修飾，在基因表達(dá)

4、調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。基因啟動(dòng)子區(qū)及其附近區(qū)域內(nèi)CpG甲基化的程度與轉(zhuǎn)錄的抑制程度關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)中，選取患支原體肺炎的綿羊4只，對肝臟組織提取DNA，根據(jù)BSP法引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，采用BSP甲基化檢測技術(shù)對該基因啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行甲基化檢測。結(jié)果如下：選用BSP甲基化檢測方法成功地檢測了擴(kuò)增出的234 bp目的片段，甲基化分析發(fā)現(xiàn)，感染MP綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)中的6個(gè)CpG位點(diǎn)有5個(gè)為甲基化位點(diǎn)，而正常綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)中的

5、6個(gè)CpG位點(diǎn)有4個(gè)發(fā)生甲基化，差異較大，證明本實(shí)驗(yàn)建立的BSP甲基化檢測技術(shù)平臺(tái)準(zhǔn)確可靠。三、綿羊MBL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與支原體肺炎相關(guān)性研究 MBL作為人類天然免疫系統(tǒng)中重要的一線抗感染分子，已表明與多種疾病相關(guān)，如一般免疫缺陷、特異性感染、囊性纖維病(CF)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）等。綿羊支原體性肺炎是由綿羊肺炎支原體所引起的一種特異性感染疾病。本研究選用3月齡綿羊43只構(gòu)建試驗(yàn)群體（攻毒組37只，對照組

6、6只），用綿羊肺炎支原體（M.ovipneumonia）標(biāo)準(zhǔn)株Y-98對攻毒組進(jìn)行氣管內(nèi)接種，運(yùn)用BSP甲基化檢測技術(shù)，成功檢測了37只攻毒組綿羊及6只對照組綿羊中MBL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及血清中MBL濃度水平情況，結(jié)果如下：（1）攻毒后，攻毒組中MBL血清水平呈降低趨勢，且差異極顯著（p＜0.01），而對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未顯示顯著性差異；（2）所選目的片段中共6個(gè)CpG位點(diǎn)，對照組有2~4個(gè)甲基化位點(diǎn)，主要集中在CpG1、CpG2、Cp

7、G3和CpG6而位點(diǎn)4、5均未發(fā)生甲基化；攻毒組中有4~6個(gè)甲基化位點(diǎn)，比較對照組而言，CpG3、CpG4和CpG5甲基化顯著（p＜0.05）；（3）6只攻毒試驗(yàn)中死亡的綿羊檢測到甲基化并且血清水平MBL極顯著（p＜0.01）降低的標(biāo)本中，CpG5甲基化發(fā)生率極顯著（p＜0.01）高于其它5個(gè)CpG檢測位點(diǎn)，CpG3和CpG4甲基化發(fā)生率顯著（p＜0.05）高于剩余3個(gè)CpG位點(diǎn)，而CpG1和CpG2位點(diǎn)甲基化發(fā)生率在攻毒組和對照組間則