抗人AFP單鏈抗體的制備和鑒定.pdf

1、四川大學博士學位論文抗人AFP單鏈抗體的制備和鑒定姓名：張平申請學位級別：博士專業(yè)：醫(yī)學免疫學指導教師：蔡美英20030430墮型苧堂墮主絲奎．比較顯示：人A F P 與H S A 有5 0 ％氨基酸同源。凍存復舒的3 株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體有2 株與人血清白蛋白存在嚴重交叉反應，最后篩選出1 株與人血清白蛋白無交叉反應的雜交瘤細胞株用于以后的研究；提取的R N A 有2 8 S ，1 8 S ，5 S 三條帶明顯，無降解；經R

2、T - P C R擴增的V H 和v L 基因大小位于2 5 0 b p 和5 0 0 b p 之聞，V H 略大于V L ：經重疊延伸P C R 擴增，將V H 和V L 連接后構建的S c F v 基因大約7 5 0 b p ；酶切及P C R 鑒定顯示：S c F v J 下確克隆至p G E M ．T 載體，成功構建了p G E M ．A 質粒；測序結果顯示：S c F v 基因由6 9 9 個堿基組成，其中含3 3 9 b p

3、 的V H 和3 1 5 b p 的V L 及4 5 b p 的連接肽堿基，閱讀框架正確；p E T ．A 質粒轉化大腸桿菌B L ．2 1 ( D E 3 ) ，誘導篩選出5 株有相應分子量大小的陽性菌落，提取質粒，經酶切、P C R 、測序鑒定顯示成功構建了p E T ．A 質粒，根據測序結果推導S c F v 由2 3 3 個氨基酸組成，V H 有1 1 3 個，V L 有1 0 5 個，兩者由( 0 4 S ) 3 連接肽連接，

4、與預期結果一致。細菌溶解后反復洗滌可獲得較高純度的蛋白：包涵體變性后采用透析復性的方法可使復性率達7 4 ％。S D S ．P A G E 電泳顯示：T r x A ．S c F v 融合蛋白分子量約4 1 K d ，酶切后純化的S c F v 分子量約2 7 K d ，T r x A 分子量約1 4 K d 。抗體活性經E L I S A 抑制實驗顯示，復性后抗體活性為單克隆抗體的2 5 ％，經純化后S c F v 抗體活性增加到單克