抗黃曲霉毒素B-,1-單鏈抗體的篩選和鑒定.pdf

1、黃曲霉毒素B1(Aflatxoni B1，AFB1)是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種毒素，它的危害性主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈的毒性和致癌性，由于它在花生、玉米等食品中廣泛存在，因此嚴(yán)重危害了人們的身體健康。在現(xiàn)代社會(huì)里，隨著人們生活水平的提高，人們?nèi)找骊P(guān)注食品安全問(wèn)題。目前食品安全已引起各國(guó)政府的密切關(guān)注，歐盟在2000年就提出了世界上安全標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，其中AFB1為2μg/kg，總黃曲霉毒素為4μg/kg。
　　 用AFB1-BSA固相化

2、抗原包被酶標(biāo)板，從Tomlinson單鏈抗體庫(kù)中篩選抗AFB1抗體。實(shí)驗(yàn)中分別采用甘氨酸洗脫、胰蛋白酶洗脫和游離AFB1競(jìng)爭(zhēng)洗脫三種不同的洗脫方法對(duì)吸附在酶標(biāo)板上的噬菌體抗體進(jìn)行特異性洗脫。經(jīng)過(guò)三輪篩選后，隨機(jī)挑取46個(gè)克隆，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用AFB1競(jìng)爭(zhēng)洗處理得到的抗體庫(kù)中46個(gè)克隆中有28個(gè)陽(yáng)性克隆，將此28個(gè)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化到HB2151可溶性表達(dá)，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基上清全為陰性，反復(fù)凍融破碎菌體，取沉淀上清ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5個(gè)

3、陽(yáng)性克隆的沉淀上清呈陽(yáng)性。采用親和層析的方法對(duì)細(xì)胞破碎液進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，在電泳圖上獲得一條純化后的單一條帶。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)后得到2個(gè)能與游離AFB1特異性結(jié)合的陽(yáng)性克隆，抑制率達(dá)到50%以上。酶切、PCR和DNA測(cè)序鑒定?；蛐蛄袦y(cè)定表明scFv屬于人類免疫球蛋白可變區(qū)。
　　 為了提高可溶性蛋白的表達(dá)量，研究了誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和葡萄糖濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，通過(guò)對(duì)溫度、IPTG濃度和葡萄糖濃