TCRγδ-Ig融合蛋白抗人卵巢癌活性的研究及功能性抗人TCRγδ抗體及單鏈抗體的制備和鑒定.pdf

1、二十余年來，腫瘤的抗體靶向治療發(fā)展迅速。曲妥珠單克隆抗體(Trastuzumab)和利妥昔單克隆抗體(Rituximab)分別被用于靶向性治療乳腺癌轉(zhuǎn)移和非何杰金式淋巴瘤；并取得了良好的臨床治療效果。腫瘤靶向治療的關(guān)鍵在于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原。然而，已獲鑒定的腫瘤特異性抗原數(shù)量較少，這大大限制了應(yīng)用抗體進(jìn)行腫瘤靶向治療的發(fā)展。
　　 除了抗體，腫瘤浸潤性T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)也能特異地識別

2、腫瘤抗原，這使之成為腫瘤靶向治療的理想候選者。據(jù)報(bào)道，應(yīng)用TCRαβ進(jìn)行腫瘤靶向治療的研究已取得了初步的進(jìn)展。TCRγ9δ2在TCR缺失的JRT3-T3.5細(xì)胞中表達(dá)，能夠賦予后者識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，表明TCRγ9δ2在γ9δ2T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷中起著關(guān)鍵性作用。對腫瘤細(xì)胞的特異識別使TCRγ9δ2可能像抗體一樣應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。更重要的是，與TCRαβ相比，TCRγδ的抗原識別不受主要組織相容性復(fù)合物(Major his

3、tocompability complex，MHC)限制，其抗原識別譜可能更廣。因此，TCRγδ應(yīng)用于腫瘤靶向治療可能也具有一定優(yōu)勢。
　　 本課題組致力于研究TCRγ9δ2在腫瘤靶向治療中的作用。在前期工作中，本組在人卵巢上皮癌浸潤性T淋巴細(xì)胞中獲得了一個(gè)優(yōu)勢TCRδ2鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(complementary determining region 3，CDR3)序列，將其命名為OT3。實(shí)驗(yàn)證明，TCRγ9δ2(OT3)是卵巢

4、癌反應(yīng)性的特異性TCR。用OT3取代抗體重鏈CDR3區(qū)，構(gòu)建的CDR3δ(OT3)移植性抗體，保留了其與多種腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特性，但親和力較弱。為了獲得既具有對腫瘤抗原的高親合特性，又具有抗體生物學(xué)功能的融合蛋白，我們將TCRγ9δ2(OT3)的完整胞外段或可變區(qū)分別與人IgG1重鏈恒定區(qū)連接起來，構(gòu)建了三種TCRγδ-Ig融合蛋白，即TCRγ9δ2(OT3)-Fc，TCRVδ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ。體外

5、結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，三種融合蛋白中，TCRγ9δ2(OT3)-Fc與卵巢癌細(xì)胞系和組織的結(jié)合能力最強(qiáng)。
　　 因此，本研究的第一部分工作，主要研究了TCRγ9δ2(OT3)-Fc的腫瘤結(jié)合能力和體內(nèi)外抗卵巢癌效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，除了卵巢癌，TCRγ9δ2(OT3)-Fc在體外能結(jié)合其他多種腫瘤細(xì)胞系，提示其可能具有廣譜腫瘤靶向性;體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TCRγ9δ2(OT3)-Fc的加入可以明顯增強(qiáng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Periphe

6、ral blood mononuclear cells，PBMCs)對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和ES-2細(xì)胞的殺傷作用，并具有劑量依賴的特性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在人卵巢癌移植瘤裸鼠模型中，與PBS對照組相比，TCRγ9δ2(OT3)-Fc能夠有效抑制腫瘤生長，并延長荷瘤裸鼠的生存期。這些數(shù)據(jù)表明，TCRγ9δ2(OT3)-Fc融合蛋白保留了TCRγδ的抗原識別特性，同時(shí)也兼具抗體Fc段介導(dǎo)的效應(yīng)功能，將其應(yīng)用于卵巢癌的靶向治療是可行的。而

7、且，由于TCRγ9δ2(OT3)-Fc能結(jié)合多種腫瘤細(xì)胞系，具有潛在的廣譜腫瘤靶向性，有望擴(kuò)大腫瘤靶向治療的應(yīng)用范圍。
　　 本研究的第二部分工作，主要是功能性抗人TCRγδ抗體的研究，以期用其擴(kuò)增γδT細(xì)胞，應(yīng)用于腫瘤的過繼免疫治療。在腫瘤免疫中，γδT細(xì)胞對腫瘤抗原的識別不具M(jìn)HC限制性，能分泌大量干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ），且能殺傷多種腫瘤細(xì)胞系，從而具有用于腫瘤過繼免疫治療的潛能。由于γδT細(xì)胞僅

8、占外周血T細(xì)胞的1～10％，獲取足夠數(shù)量且有相應(yīng)生物學(xué)功能的γδT細(xì)胞，成為制約其應(yīng)用于過繼免疫治療的瓶頸。目前獲得用于過繼免疫治療的γδT細(xì)胞的方法有兩種，一種是磷酸抗原刺激增殖，如4-羥基-3-甲基-2-己烯基-4-焦磷酸(HMBPP)，另一種是固相化抗體體外擴(kuò)增；兩種方法均需聯(lián)合白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）。本課題組重點(diǎn)研究固相化抗體體外擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的過繼免疫治療。但是由于目前使用的抗TCRγδ單克隆

9、抗體是鼠源的，有產(chǎn)生人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA)反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)，因而在臨床治療上受到一定限制。因此，本文第二部分的工作，旨在構(gòu)建穩(wěn)定分泌抗人TCRγδ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建人源化的抗人TCRγδ抗體或單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)。通過對人源化抗體或單鏈抗體的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，以驗(yàn)證其能否替代鼠源親本抗體，用于制備過

10、繼免疫治療的γδT細(xì)胞制劑。
　　 首先，我們以TCRγ9δ2(OT3)-Fc為免疫原免疫BALB/c小鼠，用常規(guī)雜交瘤技術(shù)獲得能穩(wěn)定分泌抗人TCRγδ抗體的雜交瘤細(xì)胞株。并用固相化抗體體外擴(kuò)增的方法，篩選到分泌能體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的單抗的雜交瘤細(xì)胞株--G5-4。
　　 其后，通過RT-PCR法，從雜交瘤細(xì)胞株G5-4的cDNA中分別擴(kuò)增獲得抗體的輕重鏈的可變區(qū)基因；并分別構(gòu)建了嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒G5-4-pAc-κ-

11、CH3和單鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒G5-4ScFv-pET22b(＋)。嵌合抗體和單鏈抗體分別在在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌TransB(DE3)中得到成功表達(dá)。
　　 最后，重點(diǎn)對單鏈抗體G5-4ScFv的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，單鏈抗體G5-4ScFv能與TCRγδ特異結(jié)合；固相化G5-4ScFv能刺激人PBMC中γδT細(xì)胞增殖，2周時(shí)其純度可達(dá)90%；擴(kuò)增得到的γδT細(xì)胞能有效殺傷腫瘤細(xì)胞系，如Daudi細(xì)胞；并在刺激

12、時(shí)能有效分泌干擾素-γ（INIFN-γ）和TGF-α。提示，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并表達(dá)了具有生物學(xué)活性的抗人TCRγδ單鏈抗體G5-4ScFv，為進(jìn)一步研究其用于制備腫瘤過繼免疫治療的細(xì)胞制劑奠定了基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本文的研究有以下成果：
　　 1．我們構(gòu)建并表達(dá)了具有較高親和力的TCRγ9δ2(OT3)-Fc融合蛋白，該蛋白兼具TCRγδ的抗原識別特性和抗體的效應(yīng)功能。
　　 2．TCRγ9δ2(OT3)-Fc

13、在體內(nèi)外均表現(xiàn)出抗卵巢癌的功能，提示有應(yīng)用于卵巢癌靶向治療的前景。
　　 3.由于TCRγ9δ2(OT3)-Fc的潛在廣譜腫瘤識別特性，因此，它具有應(yīng)用于多種腫瘤靶向治療的可能性。
　　 4．成功構(gòu)建了穩(wěn)定分泌抗人TCRγδ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
　　 5．構(gòu)建并表達(dá)了人源化的抗人TCRγδ抗體或單鏈抗體。
　　 6．單鏈抗體G5-4ScFv能與人TCRγδ特異結(jié)合，固相化后能有效刺激人PBMC中γδ