調(diào)控mTOR信號通路對癲癇的作用及其機制研究.pdf

1、mTOR(mammalian target of rapamycn)信號通路是一條調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細胞生長、增殖等的信號通路。以往研究表明，mTOR信號通路參與了紅藻氨酸(KA)誘導的大鼠癲癇的發(fā)生，并導致一系列癲癇后病理變化。雷帕霉素（Rapamycin）是mTOR信號通路特異性抑制劑，能夠抑制mTOR信號通路的異常激活，并改善癲癇后病理變化以及減少自發(fā)性癲癇的產(chǎn)生，從而發(fā)揮潛在的抗癲癇作用。
　　因此，在研究中探討了雷帕霉素給

2、藥在正常SD大鼠以及KA誘發(fā)癲癇模型大鼠中對mTOR信號通路的作用。同時，構(gòu)建條件性敲除神經(jīng)前體細胞Rptor基因的小鼠，探討敲除雷帕霉素作用靶點Raptor蛋白后對癲癇及并發(fā)癥的影響，以明確mTOR信號通路在癲癇調(diào)控中的作用。
　　第一章雷帕霉素對mTOR信號通路的矛盾性作用
　　目的:前期研究發(fā)現(xiàn)，在KA誘導癲癇模型中提前較短時間給予雷帕霉素，更嚴重地激活以S6蛋白磷酸化為檢測指標的mTOR信號通路，這與雷帕霉素對mTO

3、R信號通路的抑制性作用相矛盾。因此，本研究擬在正常SD大鼠及KA誘導的SD大鼠癲癇模型中對雷帕霉素的矛盾性作用進行更詳細的研究，明確雷帕霉素對mTOR信號通路及癲癇的作用。
　　方法:在正常SD大鼠中給予單次不同劑量(0.3，1，3，10mg/kg)的雷帕霉素以及給予單次單一劑量雷帕霉素(3mg/kg)作用不同時間點(1，3，6，15，24h)，以確定雷帕霉素的量效與時效關(guān)系。同時，在KA誘導急性癲癇發(fā)作前，不同時間(1，3，6，

4、15，24h)給予雷帕霉素以及雷帕霉素給藥后急性癲癇發(fā)作不同時間(1，3，6，15，24h)，檢測S6蛋白磷酸化，以探討雷帕霉素對癲癇mTOR信號通路的作用。另外，監(jiān)測雷帕霉素不同時間(1，10h)給藥后癲癇癥狀以及癲癇后神經(jīng)細胞死亡，探討雷帕霉素矛盾性作用的影響。最后，檢測mTOR信號通路中Akt，Raptor，Rictor，S6k，S6蛋白磷酸化，以及給予Akt抑制劑哌立福辛(Perifosine)，探討雷帕霉素矛盾性作用的可能機制

5、。
　　結(jié)果:
　　1.在正常SD大鼠中，提前3-24小時給予雷帕霉素能夠抑制S6蛋白磷酸化，并呈劑量依賴性，而提前1小時給予雷帕霉素反而矛盾性增加了S6蛋白磷酸。
　　2.在KA誘導的急性癲癇模型中，提前10小時給予雷帕霉素，能夠抑制癲癇導致mTOR信號通路的激活，而提前1-6小時給予雷帕霉素，反而矛盾性加重了癲癇導致mTOR信號通路的激活。
　　3.提前1小時給予雷帕霉素，加重了癲癇的嚴重程度、癲癇持續(xù)時間及

6、神經(jīng)細胞死亡，而提前10小時給予雷帕霉素，對癲癇癥狀沒有影響，但是可以減少神經(jīng)元死亡。
　　4.雷帕霉素對S6蛋白磷酸化的矛盾性作用與上游mTOR信號通路相關(guān)，并且，提前給予Akt抑制劑哌立福辛能夠逆轉(zhuǎn)雷帕霉素對S6磷酸化的矛盾性作用。
　　結(jié)論:短時間給予雷帕霉素誘導了S6蛋白激活，廢除了雷帕霉素的抗癲癇作用。雷帕霉素對mTOR通路的調(diào)節(jié)具有高度復雜性，其原因可能與上游信號通路相關(guān)。
　　第二章選擇性敲除神經(jīng)前體細胞

7、中Rptor基因敲除對mTOR信號通路的作用
　　目的:Raptor蛋白是mTOR信號通路中mTOR激酶調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，由Rptor基因編碼。前期研究提示mTOR信號通路在癲癇發(fā)生中具有重要作用。為了探討Raptor蛋白在癲癇及癲癇導致的相關(guān)疾病中的作用，制備在神經(jīng)前體細胞中敲除Rptor的條件性敲除小鼠，以明確Raptor蛋白的作用。
　　方法:構(gòu)建條件性敲除神經(jīng)前體細胞Rptor基因小鼠，對基因敲除小鼠外觀及發(fā)育進行觀察。

8、同時，觀察在正常情況及紅藻氨酸(KA)致病后，基因敲除小鼠mTOR信號通路的改變及癲癇狀態(tài)。FJB染色和TIMM染色分別觀察KA致癇后基因敲除小鼠腦神經(jīng)細胞死亡情況和苔蘚纖維發(fā)芽情況，并EEG記錄致癇后基因敲除小鼠自發(fā)性癲癇頻率。最后，水迷宮實驗，曠場實驗和興奮性實驗觀察小鼠行為學變化。
　　結(jié)果:
　　1.Rptor基因敲除小鼠（Rptor CKO mice）在外觀與對照小鼠沒有區(qū)別，并且Rptor基因敲除后，mTORC1

9、信號通路被抑制。
　　2.Rptor基因敲除小鼠腦重及體重比對照小鼠低，并且大腦上皮層神經(jīng)元厚度減少。
　　3.KA誘導癲癇后，KA導致的mTOR信號通路過度激活得到抑制，但Rptor基因敲除小鼠癲癇狀態(tài)與對照小鼠沒有明顯差異。
　　4.在Rptor基因敲除小鼠中，存在極少次數(shù)的自發(fā)性癲癇，且癲癇導致的苔蘚纖維發(fā)芽得到改善。
　　5.Rptor基因敲除小鼠在一定程度能夠減少KA導致的認知障礙，減少焦慮行為及過度興