XFM及其頡頏劑對(duì)LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路及Orexin系統(tǒng)的作用.pdf

1、小型豬專用復(fù)合麻醉劑(XFM)及其頡頏劑具有效果確切、安全、副作用小及使用方便的特點(diǎn)。但目前其麻醉鎮(zhèn)痛和催醒機(jī)理尚未完全闡明。最新研究表明細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與動(dòng)物全身麻醉及催醒機(jī)制有密切的聯(lián)系。LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路在調(diào)控局部樹突興奮性調(diào)節(jié)及麻醉長(zhǎng)時(shí)程調(diào)節(jié)中起重要作用，因此，推測(cè)mTOR可能參與了麻醉的鎮(zhèn)痛調(diào)控。Orexin系統(tǒng)可調(diào)控睡眠與覺醒，推測(cè)Orexin系統(tǒng)參與了麻醉的催醒調(diào)控。為全面了解XFM及其頡頏劑在大鼠中樞

2、神經(jīng)系統(tǒng)中的交互作用，本實(shí)驗(yàn)從LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路和Orexin系統(tǒng)兩方面進(jìn)行研究。首先，以切口痛大鼠為模型，選取mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白LKB1、AMPK及下游轉(zhuǎn)錄因子4EBP1，研究XFM及其頡頏劑的麻醉鎮(zhèn)痛機(jī)理，從分子水平對(duì)XFM及其頡頏劑交互作用機(jī)制進(jìn)行探討。其次，選取Orexin A和Orexin B研究XFM及其頡頏劑的催眠與覺醒機(jī)理，分析XFM及其頡頏劑在大鼠下丘腦側(cè)腦區(qū)的交互作用。
　　實(shí)驗(yàn)分

3、為XFM及其頡頏劑對(duì)mTOR信號(hào)系統(tǒng)和對(duì)Orexin系統(tǒng)的作用兩部分。研究對(duì)mTOR信號(hào)系統(tǒng)的作用:將126只SD大鼠分為空白對(duì)照組（6只），切口痛對(duì)照組（24只），生理鹽水切口痛組（24只），麻醉劑組（24只），頡頏劑組（24只）和麻醉催醒交互組(24只)。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠于腹腔注射0.5％戊巴比妥鈉30 mg/kg后，對(duì)足底實(shí)施手術(shù)切割建立切口痛模型。各組大鼠分別腹腔注射生理鹽水、XFM或/和頡頏劑（對(duì)照組不給藥）后，在

4、相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采用頸部移位法處死大鼠并迅速取樣，取樣部位為大腦、海馬、丘腦、小腦、腦干和脊髓L4～L5節(jié)段。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各樣品LKB1 mRNA、AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA和4EBP1 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，利用western blot方法檢測(cè)各樣品p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα和p-4EBP1/4EBP1蛋白質(zhì)磷酸化水平。研究對(duì)Orexin系統(tǒng)的作用:將78只SD大鼠分為空白對(duì)照組（6

5、只），麻醉劑組（24只），頡頏劑組(24只)和麻醉催醒交互組（24只）。各實(shí)驗(yàn)組大鼠分別腹腔注射XFM和/或頡頏劑后，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死并采取下丘腦側(cè)腦區(qū)。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Prepro-orexin mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，Western blot方法檢測(cè)OrexinA、OrexinB蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　(1) XFM及其頡頏劑對(duì)切口痛大鼠不同腦區(qū)及脊髓LKB1的影響
　　XFM能明顯激活大鼠

6、腦內(nèi)小腦、丘腦、海馬和腦干內(nèi)LKB1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化，磷酸化水平與mRNA轉(zhuǎn)錄變化較為一致;單獨(dú)腹腔注射頡頏劑能抑制大腦、小腦、海馬和脊髓內(nèi)LKB1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化;使用頡頏劑催醒XFM后，切口痛大鼠大腦和小腦的LKB1蛋白磷酸化水平與對(duì)照組相比極顯著降低(P＜0.01)，表明XFM的全麻作用可能與誘導(dǎo)小腦、丘腦、海馬和腦干內(nèi)的LKB1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化有關(guān)，頡頏劑的催醒作用可能與其在小腦和海馬逆轉(zhuǎn)XFM對(duì)L

7、KB1的誘導(dǎo)激活有關(guān)。
　　(2) XFM及其頡頏劑對(duì)切口痛大鼠不同腦區(qū)及脊髓AMPK的影響
　　切口痛大鼠小腦、丘腦、腦干、海馬和脊髓部位的AMPKα1和AMPKα2 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量和AMPKα磷酸化水平在XFM麻醉后，與對(duì)照組相比極顯著升高(P＜0.01)，且磷酸化水平與mRNA轉(zhuǎn)錄水平一致;單獨(dú)腹腔注射頡頏劑能明顯抑制小腦、海馬和腦干的AMPKα磷酸化水平和mRNA轉(zhuǎn)錄;使用頡頏劑催醒XFM后，小腦、腦干和脊髓的磷

8、酸化水平和mRNA轉(zhuǎn)錄受到抑制，表明XFM的全麻作用可能與誘導(dǎo)小腦、丘腦、腦干、海馬和脊髓內(nèi)的AMPKα磷酸化和mRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，頡頏劑的催醒作用可能與其在小腦、海馬和腦干逆轉(zhuǎn)XFM對(duì)AMPKα的誘導(dǎo)激活有關(guān)。
　　(3) XFM及其頡頏劑對(duì)切口癰大鼠不同腦區(qū)及脊髓4EBP1的影響
　　XFM能極顯著升高切口痛大鼠各個(gè)腦區(qū)及脊髓部位的4EBP1 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量和磷酸化水平(P＜0.01);小型豬麻醉頡頏劑能顯著降低小腦、

9、丘腦、海馬、腦干的4EBP1 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量和磷酸化水平(P＜0.05)，使用頡頏劑催醒XFM后，大腦、小腦和丘腦的磷酸化水平與對(duì)照組相比受到顯著抑制(P＜0.05)，XFM的全麻作用可能與誘導(dǎo)各個(gè)腦區(qū)及脊髓4EBP1 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄和磷酸化有關(guān)，頡頏劑的催醒作用可能與其在小腦、丘腦、海馬、腦干逆轉(zhuǎn)XFM對(duì)4EBP1的誘導(dǎo)激活有關(guān)。
　　(4) XFM及其頡頏劑對(duì)Prepro-orexinmRNA轉(zhuǎn)錄和Orexin A、Or

10、exinB表達(dá)的影響
　　XFM能極顯著抑制下丘腦側(cè)腦區(qū)Prepro-orexinmRNA的轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，顯著降低OrexinA和Orexin B蛋白表達(dá)(P＜0.05)，單獨(dú)腹腔注射頡頏劑能激活下丘腦側(cè)腦區(qū)Prepro-orexinmRNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)OrexinA和OrexinB蛋白表達(dá)。使用頡頏劑催醒XFM后，大鼠下丘腦側(cè)腦區(qū)Prepro-orexinmRNA的轉(zhuǎn)錄和OrexinA蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.

11、05)，表明XFM的作用是通過抑制下丘腦側(cè)腦區(qū)Prepro-orexinmRNA轉(zhuǎn)錄和Orexin A、OrexinB蛋白表達(dá)進(jìn)行的，頡頏劑的促覺醒作用是可能與逆轉(zhuǎn)下丘腦側(cè)腦區(qū)Prepro-orexin mRNA轉(zhuǎn)錄和OrexinA蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　綜上所述得出以下結(jié)論:
　　(1) XFM對(duì)LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路及下游因子具有一定的激活作用，這種促進(jìn)作用主要與小腦、丘腦、海馬、腦干有關(guān)，這可能是該LKB1-

12、AMPK-mTOR信號(hào)通路參與麻醉與鎮(zhèn)痛的靶位。
　　(2)小型豬麻醉頡頏劑能夠抑制切口痛大鼠不同腦區(qū)及脊髓內(nèi)的LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路及下游因子，對(duì)小腦和海馬部?jī)?nèi)的信號(hào)分子抑制較明顯，頡頏劑效能的發(fā)揮可能是通過LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　(3)小型豬麻醉頡頏劑與XFM對(duì)LKB1-AMPK-mTOR信號(hào)通路及下游因子的作用相反，這可能是XFM與頡頏劑的交互作用在分子水平的體現(xiàn)，但頡頏劑未能