髓系抑制細(xì)胞(MDSC)和mTOR信號(hào)通路在哮喘發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：MDSC(Myeloid derived suppressor cell)是髓系來(lái)源的免疫抑制細(xì)胞，在急慢性炎癥、腫瘤及重癥感染等疾病中MDSC明顯增多，且負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase)/蛋白激酶B（protein kinase B）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin）/p70S6k（簡(jiǎn)稱mTOR）信號(hào)通路，主要調(diào)控細(xì)胞

2、的生長(zhǎng)分化，其還可改變下游效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，影響細(xì)胞凋亡、增殖、血管生成及轉(zhuǎn)化，參與核糖體合成、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)多種疾病的發(fā)生及發(fā)展與 mTOR號(hào)通路的改變相關(guān)，其非常有希望成為治療新靶點(diǎn)。支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種慢性炎癥性疾病，已經(jīng)嚴(yán)重危害了兒童的身心健康，并且70％-80%的兒童發(fā)病年齡小于5歲，如果不能及時(shí)的明確診斷并給予有效治療治，將會(huì)隨著病程的延長(zhǎng)產(chǎn)生氣道重塑，從而失去最佳的治療時(shí)機(jī)，對(duì)孩子

3、傷害更大。MDSC及mTOR信號(hào)通路已廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究及臨床治療中，而在哮喘中的研究較少，且在哮喘發(fā)病中發(fā)病機(jī)制未明確，此外，二者是否共同在哮喘中起作用及如何作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：內(nèi)源、外源MDSC引起Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生中的作用及機(jī)制研究。
　　目的：探討內(nèi)源、外源MDSC與Th1/Th2失衡在哮喘發(fā)生中的分子機(jī)制。
　　方法：為了研究?jī)?nèi)源 MDSC在哮喘發(fā)生中的作用，通過(guò)臨

4、床研究設(shè)哮喘組、干預(yù)組與對(duì)照組，ELISA檢測(cè)各組外周血清 IL-10、IL-12水平，流式細(xì)胞檢測(cè)外周血MDSC比例，并分析MDSC與 IL-10、IL-12的相關(guān)性；同時(shí)建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，設(shè)哮喘組、干預(yù)組及對(duì)照組，HE、PAS染色觀察各組氣道炎癥，免疫組化染色觀察各組MDSC、IL-10及IL-12水平；為了探討外源 MDSC在哮喘中的抑制作用，建立大腸癌小鼠模型，標(biāo)記并提取MDSC，注入哮喘小鼠模型中，分為對(duì)照組，哮喘組，干預(yù)組及

5、移植組，觀察各組哮喘氣道重塑的表達(dá)，檢測(cè)各組血清及BALF中IL-10及IL-12水平，分析移植組MDSC與IL-10，MDSC與IL-12的相關(guān)性。
　　結(jié)果：⑴哮喘發(fā)作組血清MDSC與IL-10水平均顯著升高，且兩者呈正相關(guān)，發(fā)作組的IL-12水平顯著下降，MDSC與IL-12呈負(fù)相關(guān)。⑵哮喘組小鼠氣道炎癥、氣道重塑顯著，肺組織MDSC及IL-10水平均顯著升高，IL-12水平顯著下降。⑶從骨髓細(xì)胞懸液中可提取較高比例的MDS

6、C，外源MDSC移植入哮喘小鼠后氣道重塑顯著改善，肺組織 MDSC及 IL-10水平顯著下降，且兩者呈正相關(guān)，IL-12水平干預(yù)后顯著上升，且與MDSC呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：內(nèi)源MDSC增高時(shí) IL-10升高、IL-12降低，導(dǎo)致Th1/Th2失衡與哮喘發(fā)生相關(guān)；外源MDSC可使IL-10降低、IL-12升高，糾正Th1/Th2失衡從而抑制哮喘。
　　第二部分：mTOR信號(hào)通路引起Th17/Treg失衡在哮喘中的作用及機(jī)制研

7、究。
　　目的：驗(yàn)證mTOR信號(hào)通路是否通過(guò)誘發(fā)Th17/Treg失衡從而在哮喘發(fā)生時(shí)起誘導(dǎo)作用，抑制通路的各個(gè)靶點(diǎn)是否通過(guò)糾正Th17/Treg失衡在哮喘發(fā)生時(shí)起抑制作用，比對(duì)不同的抑制劑應(yīng)用后各個(gè)靶點(diǎn)水平。
　　方法：臨床研究設(shè)哮喘重度發(fā)作組、輕度發(fā)作組及緩解組、肺炎組及正常對(duì)照組，用ELISA分別測(cè)定各組血清的mTOR，IL-17及TGF-β水平；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)生理鹽水對(duì)照組、卵蛋白哮喘組、布地奈德干預(yù)組，mTOR抑制劑（

8、雷帕霉素）干預(yù)組，PI3K抑制劑（LY294002）干預(yù)組，Akt抑制劑（曲西立濱）干預(yù)組，各組分別應(yīng)用HE染色、PAS染色，各組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及 p-p70S6K行免疫組織化學(xué)染色及 Western blot檢測(cè)；分別用ELISA檢測(cè)BALF及血清中的IL-17及TGF-β水平。
　　結(jié)果：⑴哮喘重度發(fā)作組較其余各組相比，血清中的mTOR及IL-17顯著升高，TGF-β顯著下降；mTOR與IL-17呈正相

9、關(guān)，與TGF-β呈負(fù)相關(guān)；其余各組之間mTOR、IL-17及TGF-β水平無(wú)顯著差別；⑵mTOR信號(hào)通路在哮喘發(fā)生時(shí)被激活，氣道重塑明顯，緩解時(shí)氣道重塑明顯改善；⑶哮喘發(fā)作時(shí)免疫組化及 Western blot檢測(cè) p-PI3K、p-Akt、p-mTOR及p-p70S6K水平均升高，干預(yù)后各指標(biāo)均顯著降低；⑷p-PI3K表達(dá)水平在曲西立濱干預(yù)組顯著高于哮喘組，哮喘組又顯著高于其余各組；p-Akt在雷帕霉素干預(yù)組顯著高于哮喘組，哮喘組又顯

10、著高于其余各組；p-mTOR及p-p70S6k的表達(dá)水平在哮喘組均顯著高于其余各組；⑸哮喘發(fā)生時(shí)小鼠BALF及血清IL-17升高、TGF-β降低，哮喘緩解時(shí) BALF及血清IL-17降低、TGF-β升高。
　　結(jié)論：mTOR信號(hào)通路激活時(shí)可引起IL-17升高、TGF-β降低，從而導(dǎo)致Th17/Treg失衡在哮喘發(fā)生時(shí)起誘導(dǎo)作用；相反，哮喘緩解時(shí) mTOR信號(hào)通路被抑制，血清IL-17降低、TGF-β升高，Th17/Treg失衡被糾

11、正；通路各個(gè)靶點(diǎn)水平在各個(gè)靶點(diǎn)抑制劑應(yīng)用后比對(duì)有差異。
　　第三部分：MDSC、mTOR信號(hào)通路通過(guò)iNOS及NO在哮喘的發(fā)生中相互作用。
　　目的：驗(yàn)證MDSC、mTOR信號(hào)通路是否通過(guò)iNOS及NO在哮喘的發(fā)生中相互作用。
　　方法：設(shè)生理鹽水對(duì)照組，卵蛋白哮喘組，布地奈德干預(yù)組，檢測(cè)各組iNOSmRNA及NO表達(dá)；哮喘組小鼠p-mTOR及p-p70S6K水平在外源MDSC注入前后的變化，注入前后iNOS及NO水平

12、的變化，哮喘小鼠中用iNOS抑制劑（L-硝基精氨酸 L-nitro-arginine LNA）注入前后p-mTOR及p-p70S6K水平變化；哮喘小鼠mTOR抑制劑（雷帕霉素）應(yīng)用后內(nèi)源MDSC、iNOS及NO的水平變化，用LNA注入哮喘小鼠中測(cè)定注入前后內(nèi)源 MDSC水平的變化（各組 iNOS及NO水平用ELISA檢測(cè)，各組p-mTOR及p-p70S6K用免疫組化染色及Western blot檢測(cè)）；ELISA測(cè)定哮喘組血清 mTOR

13、及iNOS水平，用免疫組化測(cè)檢肺組織中MDSC水平，pearson直線相關(guān)分析其中兩兩的相關(guān)性。
　　結(jié)果：⑴iNOS及NO水平在哮喘組顯著高于對(duì)照組、干預(yù)后顯著下降。⑵哮喘組小鼠外源MDSC注入后p-mTOR、p-p70S6K，iNOS及NO水平均較注入前下降； LNA注入哮喘小鼠后p-mTOR及p-p70S6K水平均下降。⑶雷帕霉素注入哮喘小鼠后內(nèi)源MDSC水平，iNOS及NO水平均較注入前下降；LNA注入哮喘小鼠后內(nèi)源MDS