大黃素通過(guò)炎癥信號(hào)通路調(diào)控癲癇發(fā)生及耐藥機(jī)制的初步研究.pdf

1、癲癇是一組由大腦神經(jīng)元反復(fù)異常同步化放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。全球有約超過(guò)4000萬(wàn)癲癇患者，我國(guó)約有600萬(wàn)癲癇患者。大多數(shù)的癲癇患者經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的規(guī)范藥物治療后，癇性發(fā)作可以得到控制。但是仍有20％-30％的患者藥物治療并不能夠減輕發(fā)作的頻率和強(qiáng)度，被稱為難治性癲病。闡明難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制，提高癲癇發(fā)作控制率一直是癲癇研究的熱點(diǎn)。
　　我們的前期研究通過(guò)腦電分析發(fā)現(xiàn)大黃對(duì)癲癇具有抑制作

2、用，其機(jī)制可能是大黃素抑制突觸前興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放直接抑制海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元EPSP，降低由于谷氨酸和NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性增高，大黃素可減輕腦水腫、升高SOD、Na+-K+ATP酶活性，降低MDA水平，影響多個(gè)病理生理通路。大黃素的抗炎作用以被越來(lái)越多的研究證實(shí)，大黃素對(duì)諸多炎癥因子、信號(hào)通路都有較為明確的作用。這就提示我們大黃素可能對(duì)癲癇的耐藥有一定作用，其機(jī)制可能是通過(guò)COX-2等炎癥通路實(shí)現(xiàn)。本論文分為兩個(gè)部分，具體

3、如下:
　　第一部分 大黃素通過(guò)炎癥信號(hào)通路對(duì)癲癇的調(diào)控
　　目的:建立海人酸(Kainic acid, KA)注射大鼠癲癇模型，并以大黃素進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)高通量細(xì)胞因子蛋白芯片分析正常大鼠、KA致癇大鼠及經(jīng)大黃素處理的癲癇大鼠海馬組織細(xì)胞因子的差異表達(dá)，分析KA致癇后細(xì)胞因子的改變及大黃素的影響，尋找新的分子治療靶點(diǎn)。
　　方法:大鼠分為正常對(duì)照組（C組），模型組（M組），大黃素干預(yù)組（T組）。C組為正常大鼠無(wú)處理，M

4、、T組大鼠腹腔注射12mg/kg的海人酸，T組大鼠腹腔注射海人酸10分鐘后腹腔注射大黃素(200mg/kg)。根據(jù)Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作級(jí)別，大鼠進(jìn)行腦電圖描記。采用HE染色及透射電鏡對(duì)大鼠海馬病理學(xué)改變進(jìn)行觀察。取大鼠海馬組織進(jìn)行蛋白提取，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。采用RayBioTM大鼠L系列抗體芯片Ⅰ(90)定量檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)情況。
　　結(jié)果:KA注射后大鼠表現(xiàn)出癲癇發(fā)作癥狀，腦電圖出現(xiàn)叢集性、陣發(fā)性發(fā)作的棘波

5、、尖波等癲癇樣波，大黃素組大鼠表現(xiàn)出現(xiàn)癲癇發(fā)作Racine分級(jí)較模型組降低。HE染色示KA注射后8小時(shí)，大鼠海馬CA3、CA4區(qū)神經(jīng)元開(kāi)始出現(xiàn)壞死、凋亡、丟失，48小時(shí)達(dá)到頂峰，此后CA3、CA4區(qū)神經(jīng)元維持穩(wěn)定，而海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元未見(jiàn)明顯減少。蛋白芯片結(jié)果提示，KA注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞因子改變，包括促炎細(xì)胞因子IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、TGF-β1、TGF-β2等在造模后短期內(nèi)即出

6、現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，24小時(shí)逐漸恢復(fù)正常，以及抗炎細(xì)胞因子B7-1/CD80、 CNTF、CNTF R、BASIC-FGF、CSK出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞膜糖蛋白正向調(diào)節(jié)因子TGF-β1、TGF-β2、RAGE在KA注射后表達(dá)增加，糖蛋白負(fù)向調(diào)節(jié)因子FRACTALKINE表達(dá)降低。大黃素能抑制KA腹腔注射導(dǎo)致的促炎因子升高及抗炎因子的下調(diào)。
　　結(jié)論:大鼠KA癲癇模型具有理想的顳葉癲癇的特征。KA注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞因子改變，包括促炎

7、細(xì)胞因子在造模后短期內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，及抗炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)。這些細(xì)胞因子都可通過(guò)Jak-STAT通路、PI3K-Akt通路、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路影響COX-2信號(hào)通路或被其影響。大黃素能抑制異常癲癇波發(fā)放，降低癲癇發(fā)作強(qiáng)度，并能抑制KA腹腔注射導(dǎo)致的促炎因子升高及抗炎因子的下調(diào)。同時(shí)，癲癇后細(xì)胞膜糖蛋白正向調(diào)節(jié)因子表達(dá)增加，負(fù)向調(diào)節(jié)因子表達(dá)降低。提示大鼠腦組織炎性反應(yīng)的過(guò)程同時(shí)伴隨著細(xì)胞膜糖蛋白的合成被增強(qiáng)。同樣，這種糖蛋白合成

8、可以被大黃素抑制。
　　第二部分 大黃素對(duì)癲癇耐藥性的影響機(jī)制
　　目的:驗(yàn)證KA點(diǎn)燃的慢性癲癇模型中是否存在P-gp的表達(dá)增高，這種高表達(dá)能否被大黃素抑制。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法、蛋白定量方法檢測(cè)大黃素對(duì)COX-2及NMDA受體的影響，以及三者對(duì)P-gp的影響，從而深入探討大黃素治療難治性癲癇的分子機(jī)制。
　　方法:大鼠分為正常對(duì)照組（C組）、模型組（M組）、大黃素治療組（E組）、苯妥英鈉治療組（P組）、聯(lián)合治療組（S

9、組）。M組、E組、P組、S組大鼠每日10時(shí)腹腔注射6mg/kg的海人酸，連續(xù)注射7天，建立慢性點(diǎn)燃模型。產(chǎn)生5次連續(xù)的2級(jí)癲癇或4次連續(xù)的3級(jí)癲癇視為點(diǎn)燃成功，以點(diǎn)燃成功記為第0天。點(diǎn)燃成功后，E組大鼠每日腹腔注射50mg/kg的大黃素注射液，P組大鼠每日給予40mg/kg苯妥英鈉灌胃，1次/日。S組每日給予40mg/kg苯妥英鈉灌胃，同時(shí)腹腔注射50mg/kg的大黃素注射液。于第3、6、9、12天將大鼠斷首，將腦組織進(jìn)行腦毛細(xì)血管分離

10、，取毛細(xì)血管上懸液與NBD-CSA在共聚焦密閉槽內(nèi)共孵育，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡對(duì)毛細(xì)血管進(jìn)行觀察，毛細(xì)血管腔內(nèi)NBD-CSA熒光密度應(yīng)用軟件進(jìn)行定量分析。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)癲癇發(fā)生后海馬COX-2、P-gp、NMDA受體的表達(dá)改變及大黃素對(duì)其的影響。應(yīng)用Western-Blot檢測(cè)癲癇發(fā)生后海馬COX-2、P-gp、NMDA受體蛋白的定量改變及大黃素對(duì)其的影響。在轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)癲癇發(fā)生后海馬COX-2、P-gp、

11、NMDA受體mRNA的定量改變及大黃素對(duì)其的影響。
　　結(jié)果:隨著癲癇時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠腦毛細(xì)血管P-gp的表達(dá)會(huì)逐漸增高，其熒光強(qiáng)度也隨之增加，9天達(dá)到峰值，其后開(kāi)始下降，分別為3d（98.8±17.4）、6d（118.8±14.4）、9d(153.8±6.67)、12d（144.7±5.25）。對(duì)照組大鼠海馬有極少COX-2蛋白表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于齒狀回、CA3和CA4區(qū)。M組KA反復(fù)注射后COX-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增高，主要

12、位于CA3及CA4區(qū)，在第3、6、9、12天無(wú)明顯差異。在P組COX-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增高，變化規(guī)律及陽(yáng)性單位數(shù)與M組無(wú)差異。E組及S組CA3及CA4區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較M組明顯減少。對(duì)照組大鼠海馬各部位均有P-gp蛋白表達(dá)，均分布于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。M組KA反復(fù)注射后P-gp陽(yáng)性單位明顯增高，分布于海馬各區(qū)，在第3、6、9、12天無(wú)明顯差異。在P組P-gp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯增高，變化規(guī)律及陽(yáng)性單位數(shù)與M組無(wú)差異。E組及S組P-gp陽(yáng)性單位較

13、M組明顯減少。對(duì)照組大鼠海馬各部位均有NMDA受體的表達(dá)。M組、E組、P組及S組NMDA受體陽(yáng)性單位均明顯增高，分布于海馬各區(qū)，在第3、6、9、12天無(wú)明顯差異。Western-Blot蛋白定量結(jié)果:COX-2的表達(dá)與P-gp的表達(dá)趨勢(shì)相同，M組及P組與C組比較顯著升高(p＜0.05)，M組與P組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)，E組及S組較M組下降(p＜0.05)，與C組無(wú)明顯差異(p＞0.05); NMDA受體的表達(dá)呈現(xiàn)出M組、C組、

14、P組及S組與C組比較顯著升高(p＜0.05)，之間表達(dá)無(wú)明顯差異(p＞0.05)。RT-PCR結(jié)果:M組及P組MDR1、COX-2基因的擴(kuò)增倍數(shù)最高，與C、E、S組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。MDR1、COX-2基因的擴(kuò)增趨勢(shì)相同。NMDA受體的擴(kuò)增在M、E、P、S組均顯著增高，與C組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:KA反復(fù)腹腔注射所致慢性癲癇后，大鼠腦毛細(xì)血管P糖蛋白的表達(dá)會(huì)逐漸增高。癲癇發(fā)生后海馬COX

15、-2蛋白、P-gp及NMDA受體的表達(dá)的持續(xù)增加，P-gp與COX-2表達(dá)規(guī)律一致，其高表達(dá)與苯妥英鈉治療無(wú)關(guān)，能被大黃素抑制。NMDA受體的高表達(dá)不能被苯妥英鈉及大黃素抑制。大黃素可能通過(guò)COX-2途徑影響P-gp的表達(dá)，但并非通過(guò)抑制谷氨酸與NMDA受體結(jié)合途徑影響COX-2從而影響P-gp的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.KA癲癇模型模型具有理想的顳葉癲癇的特征。KA注射后大鼠海馬表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞因子改變，包括促炎細(xì)胞因子

16、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、TGF-β1、TGF-β2等在造模后短期內(nèi)即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，24小時(shí)逐漸恢復(fù)正常，以及抗炎細(xì)胞因子B7-1/CD80、CNTF、CNTF R、BASIC-FGF、CSK出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。這些細(xì)胞因子都通過(guò)Jak-STAT通路、PI3K-Akt通路、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路影響COX-2信號(hào)通路或被其影響。大黃素能抑制KA腹腔注射導(dǎo)致的促炎因子升高及抗炎因子的下調(diào)。
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17、.KA反復(fù)腹腔注射所致慢性癲癇后，大鼠腦毛細(xì)血管P糖蛋白的表達(dá)會(huì)逐漸增高。癲癇發(fā)生后海馬COX-2蛋白、P-gp及NMDA受體的表達(dá)的持續(xù)增加，P-gp與COX-2表達(dá)規(guī)律一致，其高表達(dá)與苯妥英鈉治療無(wú)關(guān)，能被大黃素抑制。NMDA受體的高表達(dá)不能被苯妥英鈉及大黃素抑制。大黃素可能通過(guò)COX-2途徑影響P-gp的表達(dá)，但并非通過(guò)抑制谷氨酸與NMDA受體結(jié)合途徑影響COX-2從而影響P-gp的表達(dá)。
　　3.應(yīng)用大黃素處理后大鼠表現(xiàn)出