酮基還原酶的克隆表達(dá)及其在手性合成中的應(yīng)用.pdf

1、（R）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(R-CHBE)是用于制備手性藥物的前體，包括臨床上用于降低膽固醇的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑（他汀類(lèi)）。不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)4-氯-3-酮基丁酸乙酯(COBE)生成（R）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯主要通過(guò)生物催化來(lái)完成，生物催化具有成本低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高以及對(duì)映體選擇性等優(yōu)點(diǎn)。
　　生物合成(R)-CHBE的主要過(guò)程一般為：第一步，篩選適合催化還原COBE→(R)-CHBE的微生物

2、；第二步，基因克隆、表達(dá)和酶性質(zhì)鑒定；第三步，輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建；第四步，通過(guò)重組菌來(lái)生物催化COBE至(R)-CHBE。
　　本論文從路德酵母基因組中克隆獲得新型酮基還原酶基因（Ketoreductase，KR），在酵母菌中得到高效表達(dá)。KR作為 NADPH依賴(lài)型的酮基還原酶，這種酶催化COBE的最適溫度為30℃，最適pH為6.0。為了降低反應(yīng)成本，適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，本論文進(jìn)一步研究了酮基還原酶KR催化COBE合成產(chǎn)物(R)-

3、CHBE的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)中輔酶的再生循環(huán)。在GS115中通過(guò)構(gòu)建酮基還原酶和葡萄糖脫氫酶共表達(dá)重組菌株，利用葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)，即催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸反應(yīng)的同時(shí)還原NADP+為NADPH進(jìn)行輔酶再生。為優(yōu)化NADPH再生系統(tǒng),將酮基還原酶KR和葡萄糖脫氫酶GDH基因分別構(gòu)建到質(zhì)粒pETDUET后,轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21（DE3）中。以23 mM COBE和99 mM葡萄糖為底物，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌細(xì)胞為催化劑，反應(yīng)5.5h后，反