R型ω-轉(zhuǎn)氨酶的克隆表達(dá)及其在手性藥物合成中的應(yīng)用研究.pdf

1、ω-轉(zhuǎn)氨酶(ω-TA)是一種可逆地催化氨基與酮基互換的轉(zhuǎn)移酶，由于其產(chǎn)物光學(xué)純度高、立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，ω-轉(zhuǎn)氨酶在催化合成手性胺類化合物中得到廣泛應(yīng)用。相對(duì)于S型選擇性轉(zhuǎn)氨酶，R型選擇性轉(zhuǎn)氨酶的研究較少，而其需求量隨著手性胺類藥物的發(fā)展日趨增大，這使得R型選擇性轉(zhuǎn)氨酶具有更大的研究和應(yīng)用價(jià)值。
　　本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)基因組挖掘的方法找到了兩種新型R型ω-轉(zhuǎn)氨酶，分別為來(lái)源于洋蔥伯克霍爾德氏菌的轉(zhuǎn)氨酶pdBC以

2、及來(lái)源于尖孢鐮刀菌的轉(zhuǎn)氨酶hpFO。將這兩種轉(zhuǎn)氨酶pdBC、hpFO克隆到pET22b質(zhì)粒上，并在大腸桿菌宿主中表達(dá)，經(jīng)純化后獲得蛋白分子量大小分別為54kDa以及36 kDa。
　　在以R-苯乙胺、丙酮酸鈉為模式底物對(duì)轉(zhuǎn)氨酶pdBC、hpFO的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)氨酶pdBC酶活力最適溫度為35℃，最適pH值為10，在1mM濃度的金屬離子作用下，F(xiàn)e3+、Fe2+對(duì)酶具有明顯的活化作用，而Cu2+、Mn2+具有較強(qiáng)的

3、抑制作用，當(dāng)溫度大于35℃時(shí)該酶易失活，對(duì)于底物R-苯乙胺的米氏常數(shù)Km為31.238mM，對(duì)于底物丙酮酸鈉的米氏常數(shù)為26.793 mM;轉(zhuǎn)氨酶hpFO的最適的溫度為25℃，最適pH值為7，當(dāng)溫度大于25℃時(shí)該酶易失活，在1mM濃度的金屬離子作用下，Mg2+會(huì)抑制該酶的活性，而Mn2+具有活化作用，Zn2+對(duì)該酶的活化效果最為顯著，可使得酶活力提高近6倍，轉(zhuǎn)氨酶hpFO對(duì)于氨基供體R-苯乙胺的米氏常數(shù)Km為11.031 mM，對(duì)于氨基

4、受體丙酮酸鈉的Km為14.692 mM。在對(duì)轉(zhuǎn)氨酶pdBC、hpFO的底物氨基受體以及氨基供體特異性研究中，轉(zhuǎn)氨酶pdBC、hpFO表現(xiàn)出對(duì)R-苯乙胺以及苯乙酮結(jié)構(gòu)類似底物的活性。
　　在轉(zhuǎn)氨酶ATA-117催化合成西他列汀以及西他列汀中間體(R)-3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸乙酯的研究中，分別將R型選擇性轉(zhuǎn)氨酶ATA-117在大腸桿菌以及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明大腸桿菌Transetta工程菌構(gòu)建簡(jiǎn)單，