內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對(duì)世噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的調(diào)控及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和巨噬細(xì)胞之間存在十分重要的交互式應(yīng)答,在動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用。不斷有證據(jù)表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對(duì)包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的多種慢性炎癥性疾病具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究在體外細(xì)胞水平探討oxLDL刺激能否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)激活,并就大麻素受體激動(dòng)劑WIN55,212-2對(duì)oxLDL誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)控及其相應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行探討。<

2、br>　　 方法：對(duì)Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔灌洗巨噬細(xì)胞、RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞和THP-1人單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)體外培養(yǎng),oxLDL處理24小時(shí)后,用高效液相色譜分析技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)源性大麻素anandamide(AEA)和2-arachidonoylglycerol(2-AG)的水平,以實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和免疫印跡方法Western blot對(duì)大麻素特異性CB1、CB2受體mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析；

3、給予大麻素受體非選擇性激動(dòng)劑(WIN55,212-2),以MTT方法分析細(xì)胞增殖活力；給予oxLDL,大麻素受體非選擇性激動(dòng)劑(WIN55,212-2),大麻素受體1拮抗劑(AM251),大麻素受體2拮抗劑(AM630),MEK抑制劑PD98056或者U0126,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平進(jìn)行測(cè)定；實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定TNF-α mRNA水平；流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水

4、平；Western blot檢測(cè)ERK1/2的磷酸化水平；電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)方法測(cè)定核因子Kappa B(NF-κB)的DNA結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：(1)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)源性大麻素2-AG水平在6μg/ml和12μg/ml濃度的oxLDL刺激時(shí)分別升高了2.4倍和4.8倍,對(duì)AEA水平無明顯影響；而SD大鼠腹腔灌洗巨噬細(xì)胞2-AG水平在6μg/ml和12μg/ml濃度的oxLDL刺激時(shí)分別升高了1.8

5、倍和3.5倍,AEA水平升高了2.3倍和5.9倍；(2)RAW264.7巨噬細(xì)胞在3-12μg/ml的oxLDL刺激時(shí),大麻素CB1和CB2受體mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)。Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔灌洗巨噬細(xì)胞、THP-1人單核巨噬細(xì)胞在10-50μg/ml的oxLDL刺激時(shí),大麻素CB1和CB2受體mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.01)；(3)大麻素非選擇性激動(dòng)劑(WIN55,212-2)對(duì)巨噬細(xì)

6、胞增殖活力具有降低作用；(4)oxLDL呈濃度依賴性誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和ROS；(5)大麻素非選擇性激動(dòng)劑(WIN55,212-2)通過抑制ERK1/2磷酸化水平和NF-κB的活性對(duì)oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS起抑制作用；(6)大麻素非選擇性激動(dòng)劑(WIN55,212-2)降低TNF-α和ROS的效應(yīng)被其選擇性CB1受體抑制劑(AM251)和選擇性CB2受體抑制劑(AM630)部分阻斷,其中AM630

7、的作用明顯大于AM251。
　　 結(jié)論： oxLDL可誘導(dǎo)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)激活。大麻素非選擇性激動(dòng)劑(WIN55,212-2)能保護(hù)巨噬細(xì)胞免于炎癥和氧化損傷,保護(hù)機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基、降低細(xì)胞炎癥水平、抑制ERK1/2磷酸化水平和NF-κB的活性有關(guān)。對(duì)于逆轉(zhuǎn)大麻素激動(dòng)劑的作用,選擇性CB2受體抑制劑(AM1630)的作用明顯大于選擇性CB1受體抑制劑(AM251)。調(diào)控大麻素信號(hào)系統(tǒng)可能為動(dòng)脈粥樣