番茄紅素對巨噬細胞炎癥反應的調(diào)控及其分子機制探討.pdf

1、炎癥是臨床常見的一個病理過程，可以生于機體各部位的組織和各器官，通常來說，炎癥是機體的一種抗病反應，是對機體利于的防御性反應，但是過度的炎癥反應對機體又具有危害性。流行病學研究提示植物性食品具有廣泛的促進健康和防治腫瘤、心血管疾病、糖尿病、肥胖等疾病的作用。其中，植物性食物中存在的大量植物化學物質(zhì)，它們也具有廣泛的生物活性作用和健康促進作用，并逐漸受到人們的關注。番茄紅素是一種脂溶性的類胡蘿卜素，分子式為C40H56。作為一種天然色素番

2、茄紅素廣泛存在于番茄、西瓜等蔬菜和瓜果中。流行病學研究資料顯示血漿中番茄紅素的水平與一些慢性疾病如心血管疾病和癌癥的發(fā)生率呈負相關。雖然番茄紅素對一些疾病的防治作用在一定程度上歸功于其強大的抗氧化作用，但近年來的研究證據(jù)顯示番茄紅素也可通過其它的一些作用途徑發(fā)揮機體保護效應。如最近研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素除了具有抗氧化抗癌作用外，還能夠降低血漿膽固醇水平，具有抗增殖和保護血管內(nèi)皮等功能。炎癥反應與一些慢性疾病如動脈粥樣硬化，癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關

3、。番茄紅素對炎癥反應的調(diào)節(jié)作用及其具體的作用靶點和分子作用機制目前尚不十分清楚，值得深入探討。RAW264.7細胞是一種鼠源性的巨噬細胞，可被外界刺激物如LPS激活釋放大量的炎癥因子和炎癥介質(zhì)而模仿體內(nèi)的炎癥反應。
　　 目的：通過體外建立LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應模型，探討番茄紅素抗炎效應及分子作用機制，并進一步明確它對一些慢性疾病防治的作用機理。
　　 方法：
　　 ⑴將RAW264.7巨噬細胞接種于24孔

4、培養(yǎng)板，分別與1μM，5μM，10μM番茄紅素預孵育1h，再加入1μg/mL LPS孵育24h收集細胞培養(yǎng)液，分別采用亞硝酸鹽法和ELISA法檢測巨噬細胞NO和IL-6生成的水平。
　　 ⑵將RAW264.7巨噬細胞接種于6孔培養(yǎng)板，分別與1μM，5μM，10μM番茄紅素預孵育1h，再與1μg/mL LPS孵育6h收集細胞總RNA用于檢測iNOS和IL-6的mRNA表達量；或與1μg/mL LPS孵育24h后收集細胞總蛋白，采用

5、Western blot方法檢測iNOS蛋白表達量。
　　 ⑶用ERK1/2阻斷劑U0126和p38 MAPK阻斷劑SB203580分別預處理巨噬細胞2 h，再用1μg/mL LPS刺激細胞24 h。分別采用亞硝酸鹽法和ELISA法檢測巨噬細胞NO和IL-6生成水平。
　　 ⑷RAW264.7巨噬細胞分別與1μM，5μM，10μM番茄紅素預孵育1h，再加入1μg/mL LPS刺激細胞15min，收集、裂解細胞，運用不連續(xù)

6、蔗糖梯度密度超速離心法分離脂筏層和非脂筏層，采用Western blot方法檢測脂筏層和非脂筏層TLR4蛋白的表達。
　　 ⑸將TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞24h后，再加入LPS1μg/mL刺激細胞不同的時間，分別采用亞硝酸鹽法、ELISA法和Western blot方法檢測NO和IL-6合成釋放水平，NF-κB DNA結合活性以及ERK/p38磷酸化水平。
　　 結果：
　　 ①1μM，5μM，10μM番茄

7、紅素孵育RAW264.7巨噬細胞24h，測定細胞培養(yǎng)液中LDH含量和檢測MTT吸光度值。結果發(fā)現(xiàn)，各種不同濃度的番茄紅素對細胞LDH釋放量和增殖無明顯的影響，表明1-10μM番茄紅素對RAW264.7巨噬細胞無毒性作用。
　　 ②1μg/mL LPS作用RAW264.7巨噬細胞24h，細胞NO合成釋放量顯著增加，約為空白對照組的7倍(p＜0.001)。5μM，10μM番茄紅素能夠明顯抑制LPS誘導的NO合成釋放，NO分泌量較LP

8、S對照組相比分別降低了27.9％和52.8％，差距具有顯著性(P＜0.01，p＜0.001)。
　　 ③1μg/mL LPS作用RAW264.7巨噬細胞24h，細胞IL-6分泌量約為空白對照組的6倍(p＜0.001)。1μM，5μM，10μM番茄紅素能夠抑制LPS誘導巨噬細胞IL-6分泌，且隨著番茄紅素濃度增加，抑制作用增強，存在著明顯的劑量-效應關系(P＜0.05，P＜0.001，p＜0.001)。
　　 ④1μg/m

9、L LPS可明顯誘導I-κBα磷酸化，降解，促進NF-κB核轉(zhuǎn)移和增加NF-κB DNA結合活性，差距均具有顯著性(p＜0.001或P＜0.01)。1μM番茄紅素對NF-κB激活無明顯的影響，5μM和10μM番茄紅素預孵育細胞可明顯阻斷LPS誘導的I-κBα降解、NF-κB活化和核內(nèi)轉(zhuǎn)移(p＜0.001，P＜0.01或P＜0.01，p＜0.001)。說明番茄紅素可通過抑制LPS誘導NF-κB激活而降低RAW264.7巨噬細胞NO和IL-

10、6分泌。
　　 ⑤1μg/mL LPS刺激RAW264.7巨噬細胞30min后，可顯著誘導ERK1/2，p38MAPK和JNK磷酸化，與對照組比較，差距具有顯著性(p＜0.001)。1μM，5μM，10μM番茄紅素能夠抑制LPS誘導ERK1/2，p38 MAPK磷酸化，而對JNK的活化無明顯的影響，其中以5μM，10μM番茄紅素作用最強(P＜0.01p＜0.001，P＜0.001 p＜0.001)。為了進一步明確干擾ERK/p3

11、8通路激活介導了番茄紅素的抗炎效應，分別用ERK1/2阻斷劑U0126和p38 MAPK阻斷劑SB203580預處理巨噬細胞2 h，發(fā)現(xiàn)分別阻斷ERK1/2和p38 MAPK后，LPS誘導的巨噬細胞NO和IL-6分泌明顯降低，與LPS組比較，差距具有顯著性(p＜0.001p＜0.001，P＜0.01 p＜0.001)。說明ERK1/2和p38 MAPK通路激活在LPS誘導的巨噬細胞NO和IL-6生成中起著重要的作用，番茄紅素可通過阻斷L

12、PS誘導ERK/p38通路激活，進而抑制NF-κB依賴的NO和IL-6分泌。
　　 ⑥運用不連續(xù)的蔗糖密度梯度超速離心分離細胞脂筏和非脂筏層，檢測TLR4受體在脂筏和非脂筏層分布發(fā)現(xiàn)，LPS處理細胞15min較正常細胞相比，脂筏層TLR4分布明顯增加，LPS可明顯募集TLR4轉(zhuǎn)位到脂筏處分布。番茄紅素能夠抑制LPS誘導的TLR4易位到脂筏，與LPS刺激組比較，脂筏層TLR4分布減少。
　　 ⑦為了進一步證實TLR4受體在

13、LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應中的作用。TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細胞24后，LPS刺激細胞不同的時間，分別檢測NO和IL-6分泌，NF-κB DNA結合活性以及ERK/p38磷酸化水平。結果顯示，TLR4siRNA轉(zhuǎn)染細胞組，LPS刺激的NO和IL-6分泌(p＜0.001，p＜0.001)，NF-κBDNA結合活性(p＜0.001)以及ERK/p38磷酸化水平(p＜0.001，p＜0.001)均顯著低于正常細胞刺激組，而與未刺激的空白

14、對照組無明顯差別，表明抑制TLR4通路將阻斷LPS誘導的炎癥反應，TLR4在LPS誘導的炎癥發(fā)生中起著重要的銜接傳導作用。同時也說明番茄紅素可通過干預炎癥信號傳遞通路中的上游調(diào)控受體TLR4脂筏易位，從而阻斷LPS誘導的下游炎癥信號通路的傳遞和炎癥反應發(fā)生。
　　 結論：
　　 ⑴番茄紅素能夠抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中iNOS和IL-6的表達，降低iNOS和IL-6的表達產(chǎn)物NO和IL-6的生成，抑制LP

15、S誘導的巨噬細胞炎癥反應。
　　 ⑵番茄紅素能夠抑制LPS誘導的NF-κB和ERK/p38激酶的激活，阻斷ERK/p38激酶的激活可減少LPS誘導的NO和IL-6合成分泌，表明番茄紅素可通過阻斷ERK/p38激酶的激活，進而抑制NF-κB依賴的炎癥分子NO和IL-6生成。
　　 ⑶番茄紅素能夠抑制LPS誘導的TLR4受體的脂筏易位，沉默TLR4基因表達可阻斷LPS誘導的NF-κB和ERK/p38激酶的激活，NO和IL-6