五子衍宗方總黃酮對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸生殖細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究五子衍宗方總黃酮（Total flavonoids from Wuzi Yanzong prescription, TFWZ）對(duì)環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide, CTX）所致小鼠睪丸生殖細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用與機(jī)制，為進(jìn)一步研究CTX等化療藥物生殖毒性的機(jī)制提供新的方向。
　　方法：將BALB/C小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，TFWZ低和高劑量組。TFWZ低、高劑量組分別提前灌胃給予TFWZ140和2

2、80 mg/kg，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均灌胃給予等體積生理鹽水。從第三天開始，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射CTX50 mg/kg，隔兩天1次，連續(xù)10次，而正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水；同時(shí)各組繼續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物或生理鹽水。末次給予CTX后禁食不禁水，12 h后稱取小鼠體質(zhì)量，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠。(1)取雙側(cè)睪丸和附睪，稱重并計(jì)算睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)；(2)參照人類精液分析方法檢測(cè)小鼠精子濃度、精子形態(tài)正常率、精子活率；(3

3、) HE染色觀察小鼠睪丸組織形態(tài)變化；(4) TUNEL檢測(cè)小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的變化；(5) Western blot檢測(cè)小鼠睪丸生殖細(xì)胞內(nèi)凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3表達(dá)變化；(6)單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)觀察小鼠睪丸細(xì)胞DNA損傷的變化；(7)免疫組化檢測(cè)小鼠睪丸DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX的定位與表達(dá)；(8) Western blot檢測(cè)小鼠睪丸生殖細(xì)胞內(nèi)DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX、Ku70以及p-P53蛋白表達(dá)變化。
　　

4、結(jié)果：(1) CTX處理后小鼠體重、睪丸重量、睪丸指數(shù)、附睪重量、附睪指數(shù)均顯著降低；TFWZ可使小鼠體重，睪丸重量，睪丸指數(shù)，附睪重量，附睪指數(shù)升高；(2)與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠精子濃度、精子形態(tài)正常率、精子活率顯著降低；而TFWZ可顯著升高小鼠精子濃度、精子形態(tài)正常率、精子活率；(3) HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠睪丸生精小管基膜完整；基膜內(nèi)可見排列豐富整齊的各級(jí)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞，管腔內(nèi)可見精子；模型對(duì)照組小鼠生精小

5、管基膜變得不完整；基膜內(nèi)生精細(xì)胞的排列紊亂，生精細(xì)胞層數(shù)明顯減少。而TFWZ干預(yù)后小鼠睪丸生精小管基膜較為完整，基膜內(nèi)生精小管排列整齊，生精細(xì)胞層數(shù)明顯增多；(4) TUNEL結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠睪丸內(nèi)少見TUNEL陽性染色，模型對(duì)照組小鼠睪丸內(nèi)可見很多TUNEL陽性染色細(xì)胞，而TFWZ可顯著減少小鼠睪丸內(nèi)TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)，明顯減輕凋亡；(5) Western blot結(jié)果顯示，CTX處理后小鼠睪丸內(nèi)凋亡標(biāo)志蛋白Caspas

6、e-3活化水平較正常對(duì)照組顯著升高；而五子衍宗方總黃酮可降低小鼠睪丸Caspase-3活化水平；(6)單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠睪丸生殖細(xì)胞彗星圖像中尾長(zhǎng)、尾距、Olive尾矩、尾部DNA％均顯著升高；而給予TFWZ后可降低小鼠睪丸細(xì)胞彗星尾長(zhǎng)、尾距、Olive尾矩、尾部DNA％；(7)免疫組化結(jié)果可以看出，模型對(duì)照組小鼠睪丸細(xì)胞核內(nèi)DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX灶點(diǎn)數(shù)顯著增多；而TFWZ可顯著減少小鼠