甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥代動(dòng)力學(xué)與臨床療效相關(guān)性研究.pdf

1、目的：甲氨蝶呤是臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的最為常用的改變病情抗風(fēng)濕藥。常用的給藥劑量及給藥方法為：5—25mg，1次/周，口服。給藥后4-8周才開始出現(xiàn)臨床改善。目前調(diào)整給藥劑量(5-25mg 范圍內(nèi))完全依賴醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)，無明確藥代動(dòng)力學(xué)理論指導(dǎo)。依據(jù)目前給藥方法，也無法達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。
　　 給藥劑量不足，作用時(shí)間短暫，都可能導(dǎo)致治療藥物達(dá)不到有效治療目的，而延誤病情。近年

2、來，研究發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤存在細(xì)胞內(nèi)代謝，細(xì)胞內(nèi)代謝物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(methotrexate polyglutamate, MTXPG)可蓄積長達(dá)1月甚至數(shù)月。這提示細(xì)胞內(nèi)代謝物可能與小劑量甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效有關(guān)，但尚未證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)以臨床治療中的患者為對(duì)象，研究口服常用劑量7.5mg時(shí)，甲氨蝶呤單劑量藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，為臨床調(diào)整給藥劑量提供藥代動(dòng)力學(xué)理論依據(jù)。并監(jiān)測了服用常用劑量7.5mg 多劑量時(shí)，不同患者血紅細(xì)胞內(nèi)MTX

3、PG的含量變化，初步探討血紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG的量與臨床療效的相關(guān)性，從而進(jìn)一步為臨床調(diào)整甲氨蝶呤給藥劑量和給藥方法提供可行的依據(jù)。
　　 材料和方法：實(shí)驗(yàn)分為四部分：1、建立小劑量7.5mg 劑量時(shí)檢測血藥濃度方法。
　　 采用甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品(100mg/支，純度99.6％，批號(hào)100138-200603)，制備生物樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)沉淀蛋白、提純、萃取后，采用柱前衍生化，反相高效液相色譜(reversed-phasehig

4、h-performance liquid chromatography, RP-HPLC)分離，熒光檢測器監(jiān)測，制備人血漿濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立微量血樣檢測低濃度(ng/ml)甲氨蝶呤的實(shí)驗(yàn)方法。2、考察RA患者7.5mg 單劑量藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。依據(jù)明確的納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)選取RA患者4名，入組患者年齡、體重、身高均無明顯差異。受試者于服藥前抽取空白血樣并安置留置針，空腹口服7.5mg 甲氨蝶呤后，分別于服藥后第0.5,1,1.5,2,3,

5、4,6,8,12,24,48小時(shí)取血3ml 置肝素鈉抗凝試管，離心并分離血漿，儲(chǔ)存于—20℃冰箱待分析。采用已建立的反相高效液相色譜分析法檢測各時(shí)相點(diǎn)血藥濃度，以中國藥理學(xué)會(huì)編制的藥物統(tǒng)計(jì)軟件(Drug and statistics，DAS)1.0藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序，處理血藥濃度經(jīng)時(shí)變化數(shù)據(jù)，進(jìn)行室模型擬合，計(jì)算出0-12小時(shí)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)0-12小時(shí)藥時(shí)曲線下面積，用線性梯形法進(jìn)行小劑量甲氨蝶呤有限采樣法方案探討。3、建

6、立人血紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG 藥物濃度檢測方法。采用多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX-GLU4)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，制備生物樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)水解轉(zhuǎn)換反應(yīng)后，經(jīng)過沉淀蛋白、提純、萃取，采用高效液相色譜分離后，經(jīng)庫侖電化學(xué)儀進(jìn)行氧化衍生化反應(yīng)，熒光檢測器監(jiān)測，制備人血紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立微量血樣低濃度(ng/ml)MTXPG的檢測方法。
　　 4、MTXPG的藥代動(dòng)力學(xué)與臨床療效的相關(guān)性研究。依據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)選取RA患者，每周1

7、次口服甲氨蝶呤7.5mg，于第1次服藥后72小時(shí)、第1周、第4周、第8周、第12周為時(shí)間點(diǎn)采集血樣。肘靜脈取血3ml, 加入肝素抗凝的干燥試管。血樣離心后，分離血紅細(xì)胞并存于-20℃直到HPLC分析。繪制藥時(shí)曲線，觀察MTXPG的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。同時(shí)取服藥8周的患者進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，觀察受試患者血紅細(xì)胞中MTXPG濃度與腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、疼痛指數(shù)、血沉、日常生活能力等療效指標(biāo)相關(guān)性。
　　 結(jié)果：1、在選定的色譜條件下，測得甲

8、氨蝶呤色譜圖被測物峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，甲氨蝶呤的保留時(shí)間為3min；甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3631.33X+43964.2，R=0.998。在250～6.25ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)信噪比≥2(s/n ≥2)時(shí)，血漿最低檢出濃度為5 ng·mL-1，符合實(shí)驗(yàn)要求。2、單劑量7.5mg 給藥，體內(nèi)過程符合一室模型，以一室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，血漿半衰期約為3小時(shí)，受試者達(dá)峰濃度時(shí)間均不相同，約為1—2小時(shí)，達(dá)峰濃度、

9、藥時(shí)曲線下面積(area under the curve, AUC)個(gè)體間存在很大差異。依據(jù)實(shí)驗(yàn)中0-12小時(shí)藥時(shí)曲線下面積用線性梯形法估算，服藥后1、2、6、12時(shí)間點(diǎn)血漿濃度相對(duì)于時(shí)間曲線下的面積，能夠較好地預(yù)測服藥后0—12小時(shí)藥時(shí)曲線下的面積。3、在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，測得多聚谷氨酸化甲氨蝶呤色譜圖被測物峰形良好，分離完全，被測物保留時(shí)間為7 min；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=9.3317X+0.0987，R=0.999。在20～2.5n

10、g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)信噪比≥2(s/n ≥2)時(shí)，最低檢出濃度為1.2 ng·mL-1。4、服藥后72小時(shí)，在人血紅細(xì)胞中檢測到MTXPG；
　　 隨著每周1次規(guī)律服藥，人血紅細(xì)胞中的MTXPG 逐月增加。MTXPG 含量較高患者療效評(píng)定均達(dá)美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)療效評(píng)定為20％標(biāo)準(zhǔn)ACR-20(the American College ofRheumatology Criteria, ACR)。MTXPG的含量較高與較少

11、的壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、較少的腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、較低的疼痛指數(shù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)建立的微量血樣檢測低濃度甲氨蝶呤血藥濃度方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍廣，簡便準(zhǔn)確，可作為檢測小劑量甲氨蝶呤血藥濃度的常規(guī)方法。2、甲氨蝶呤血漿藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)表明：血漿半衰期約為3小時(shí)，目前給藥方法無法達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度；相同劑量給藥個(gè)體間差異大，可能是影響療效的原因之一，AUC 低于均值者應(yīng)增加劑量。可采用有限采樣法進(jìn)行藥物監(jiān)測，調(diào)整用藥劑