溶藻弧菌毒力相關(guān)基因toxR、acfA的功能研究.pdf

1、毒力相關(guān)基因toxR廣泛分布于弧菌屬細(xì)菌中,該基因最先在霍亂弧菌中被報道,后來陸續(xù)在副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌等多種弧菌中均證實(shí)存在該基因。目前對霍亂弧菌研究表明該基因編碼的跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ToxR參與調(diào)控一些主要毒力基因和外膜蛋白的表達(dá)。附屬定殖因子基因acfs是弧菌重要毒力基因之一,其表達(dá)產(chǎn)物是病原有效定植在宿主腸道上所必需的蛋白。研究表明,acfs在霍亂弧菌基因組中以基因簇形式與其它一些毒力基因串聯(lián)排列,以調(diào)

2、控霍亂毒素CT及其它一些病原菌定植所必需蛋白的合成。
　　本研究以溶藻弧菌 HY9901為對象,利用分子生物學(xué)技術(shù),成功克隆了溶藻弧菌毒力調(diào)控相關(guān)基因toxR和附屬定殖因子acfA的基因全序列,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:toxR基因的ORF為879bp,編碼292 aa,相對分子量為32.9 kDa,等電點(diǎn)為4.68,為酸性蛋白;acfA基因的ORF為648bp,編碼215 aa,該基因5?上游未發(fā)現(xiàn)原核生物基因應(yīng)具體

3、的-35區(qū)和-10區(qū)序列。演繹蛋白的相對分子量為22.2 kDa,等電點(diǎn)為為4.53,為酸性蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)ToxR蛋白在位點(diǎn)179-196處有一18aa的跨膜結(jié)構(gòu)域,沒有信號肽,有7個氨基酸殘基活性位點(diǎn);AcfA的N末端有一信號肽,有5個氨基酸殘基活性位點(diǎn),這些氨基酸殘基活性位點(diǎn)可能對于維持各自蛋白三維結(jié)構(gòu)及活性功能有重要的意義。
　　以pRE112自殺質(zhì)粒為載體,應(yīng)用插入失活突變法成功構(gòu)建了溶藻弧菌ΔtoxR、ΔacfA兩株

4、突變株,并利用Overlap PCR與同源重組技術(shù)構(gòu)建其對照株,研究了兩個突變株的致病相關(guān)的表型變化和毒力變化,同時利用2D-DIGE電泳技術(shù)尋找表達(dá)差異蛋白。結(jié)果表明 toxR的插入突變對溶藻弧菌的胞外蛋白酶的產(chǎn)量和生物膜的形成影響,但對于弧菌的生長、鞭毛幾乎沒有影響;acfA對溶藻弧菌多種生理功能具有顯著的調(diào)控作用,能促進(jìn)生長晚期的弧菌生長;對生物膜的形成也具有明顯的抑制作用,同時還能調(diào)控胞外蛋白酶活性。其中最明顯的是對弧菌鞭毛形成

5、有顯著影響。2D-DIGE電泳結(jié)果分析表明toxR或acfA的插入突變僅能影響溶藻弧菌部分能量代謝蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白及調(diào)控蛋白的表達(dá)的上調(diào)或下調(diào),但對主要毒力蛋白表達(dá)的影響不顯著。野生株、突變株對石斑魚LD50分析表明toxR的插入突變能影響溶藻弧菌對毒力,但統(tǒng)計表明野生株、突變株的毒力差異不顯著。
　　本實(shí)驗研究結(jié)果為進(jìn)一步研究溶藻弧菌基因組中其它可能的毒力基因提供了一個有效的插入失活技術(shù)平臺,同時為研究溶藻弧菌的致病機(jī)理