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文檔簡介
1、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系統(tǒng)的“針狀樣”毒力裝置(Needle-likeinjectisome)又稱為注射小體,是Ⅲ型分泌系統(tǒng)中一個復(fù)雜的微型裝置,負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白傳輸?shù)秸婧思?xì)胞。注射裝置從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)向外伸出內(nèi)中空的針到達(dá)宿主細(xì)胞表面,該注射過程一共橫跨三層膜。本研究成功克隆并分析了注射裝置上兩個重要因子:vscP基因和vscX基因。vscP基因ORF為1206 bp,共編碼401個氨基酸殘基,分子
2、質(zhì)量約為44.4 kD,等電點為5.72。構(gòu)建VscP亞基三維結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn),其與鞭毛FilK蛋白有相似構(gòu)型。vscX基因ORF為378bp,共編碼125個氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為14.2 kD,等電點為5.75。網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果顯示vscX與vscY、 vopB、sycN等有相鄰的關(guān)系。VscP和VscX各自具有一個重要結(jié)構(gòu)域,分別是T3S4(369-389aa)結(jié)構(gòu)域和Pfam(1-125aa)結(jié)構(gòu)域。
運用實時熒光定量PC
3、R技術(shù),結(jié)合2-△△Ct法分析VscP和VscX在分別在溶藻弧菌野生株HY9901、Ⅲ型分泌系統(tǒng)護(hù)航蛋白缺失株△vscO和互補(bǔ)株C-vscO菌株中不同生長時期的mRNA表達(dá)差異。結(jié)果顯示,VscP和VscX的mRNA表達(dá)量均隨溶藻弧菌HY9901生長而增長,在生長平緩期顯著上調(diào)(p<0.01)。在vscO基因缺失后,VscP和VscX的mRNA表達(dá)量均在生長晚期顯著上調(diào)(p<0.01),說明vscO的缺失破壞了VscO與VscP、Vsc
4、X之間的協(xié)同關(guān)系,使得VscP和VscX在生長晚期表達(dá)過剩。
選取VscP抗原制備亞單位疫苗,首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-vscP,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá);然后以28℃,0.4 mM IPTG,5h的最優(yōu)條件培養(yǎng)獲得重組蛋白,并用GST標(biāo)簽的純化柱純化;最后,VscP抗原免疫多鱗鱚(Sillago sihama Forskál),溶藻弧菌、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒兩周后,VscP抗原對多鱗鱚的相對免疫保護(hù)率
5、分別為67.7%、86.6%,說明VscP抗原有望成為制備具有交叉保護(hù)作用的亞單位疫苗的良好材料。
首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究VscP蛋白免疫多鱗鱚后其脾臟蛋白的表達(dá)差異,應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)對蛋白進(jìn)行分離鑒定,結(jié)果表明,VscP蛋白免疫組所得蛋白點為1316個,免疫前對照組所得蛋白點為1149個, PBS對照組所得蛋白點為1291個,PBS+佐劑對照組所得蛋白點為1316個。與對照組相比,在免疫組發(fā)現(xiàn)9個差異蛋
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