四種弧菌gyrB基因的克隆和溶藻弧菌快速檢測(cè)試劑盒的研制.pdf

1、隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化水平的提高，各種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害的發(fā)生日益頻繁，危害也越來(lái)越嚴(yán)重，已成為制約整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的最重要的因素之一。近年來(lái)，尋求水產(chǎn)動(dòng)物病害的有效防治方法越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物病害進(jìn)行有效防治的基礎(chǔ)和先決條件。因此，建立水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)方法和水產(chǎn)動(dòng)物疾病的快速診斷技術(shù)不僅能直接用于水產(chǎn)動(dòng)物病害的有效防治，還將為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)

2、健康發(fā)展奠定良好基礎(chǔ)。為此，本論文對(duì)四種水產(chǎn)病原性弧菌的種內(nèi)高度保守的gyrB基因進(jìn)行了克隆，為建立這些病原的快速診斷方法奠定了可靠前期基礎(chǔ)；本論文還對(duì)其中的溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)研制了PCR快速檢測(cè)試劑盒。具體內(nèi)容如下： 1、采用SDS裂解法提取了河流弧菌(Vibrio．fluvialis)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、擬態(tài)弧菌

3、(Vibrio mimicus)共四種水產(chǎn)病原性弧菌的基因組DNA；利用gyrB基因的通用引物對(duì)以上四種弧菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均得到了長(zhǎng)度為1200bp左右的目的片斷，通過(guò)凝膠回收并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后獲得陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后獲得了相應(yīng)的DNA序列信息。 2、由于溶藻弧菌是危害我國(guó)南方海水養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的病原性細(xì)菌之一。因而，本論文根據(jù)溶藻弧菌的gyrB基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，對(duì)2個(gè)溶藻弧菌

4、標(biāo)準(zhǔn)株和其它10種細(xì)菌性病原進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，只有兩株溶藻弧菌菌株在372bp處有一條陽(yáng)性條帶，而其它的10個(gè)菌株均無(wú)條帶產(chǎn)生，因此，本論文已成功研制出了溶藻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒，可以為水產(chǎn)動(dòng)物與人類(lèi)的溶藻弧菌病和海產(chǎn)品的食品安全提供快速、準(zhǔn)確的診斷方法和檢測(cè)技術(shù)。此外，我們利用此試劑盒對(duì)海南地區(qū)的生活區(qū)附近海水、水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖健康區(qū)海水和發(fā)病區(qū)海水進(jìn)行了溶藻弧菌存在情況的調(diào)查，結(jié)果顯示，生活區(qū)附近海水的溶藻弧菌數(shù)明顯低于