大菱鲆4種免疫相關(guān)基因的克隆、表達(dá)分析及溶藻弧菌溶血素的研究.pdf

1、海水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病是一類常見且危害大的疾病,限制了海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為解決養(yǎng)殖魚類的病害問題,增強(qiáng)養(yǎng)殖品種的抗病力,必須對病原菌的致病因子、魚類的免疫能力以及病原菌和魚類免疫器官之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行全面地了解。大菱鲆(Scophthalmus maximus)的弧菌病是一種危害性較大的細(xì)菌性疾病,國內(nèi)外對大菱鲆的弧菌病進(jìn)行了較多的研究,但對病原菌和大菱鲆免疫器官相互作用關(guān)系的實時研究較少,許多免疫相關(guān)基因尚不清楚。研制綠色生

2、物漁藥和利用免疫相關(guān)基因進(jìn)行抗病育種是促進(jìn)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效嘗試途徑,因此必須對病原菌致病機(jī)理及魚類免疫能力進(jìn)行全面深入的研究。
　　 本研究利用已構(gòu)建的感染哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的大菱鲆的頭腎和脾臟差減cDNA文庫,探索大菱鲆與哈維氏弧菌相互作用的實時特征。采用腹腔注射法分別向35尾大菱鲆注射0.15 ml(3×107CFUs/ml)的哈維氏弧菌菌液,同時設(shè)置注射等量生理鹽水和未注射的對照組(每

3、組各4尾);分別取哈維氏弧菌感染后4、8、12、24、36 h的活魚(每組4尾),注射生理鹽水8h后的對照組以及未注射組的大菱鲆進(jìn)行解剖,取頭腎、腎、心臟、肝臟、腸、肌肉、脾和鰓組織并提取總RNA以備后期RACE擴(kuò)增及表達(dá)分析使用;利用RACE技術(shù)獲得了4種免疫相關(guān)基因的全長,并使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行了理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析和同源性分析;用實時熒光定量PCR技術(shù)研究了免疫相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)以及受哈維氏弧菌感染前后的表達(dá)變化。另外

4、,還探討了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的毒力因子TLH溶血素對魚類的致病性。
　　 1.大菱鲆cathepsin D基因的克隆及表達(dá)分析
　　 Cathepsin D是溶酶體內(nèi)的一種天冬氨酸蛋白水解酶,同時也存在于巨噬細(xì)胞的內(nèi)涵體中,在生物體的發(fā)育及生理過程中起著重要的作用。本研究獲得了大菱鲆cathepsin D的全長cDNA,其ORF為1191 bp,在預(yù)測的氨基酸序列中存在由18個氨基酸組成

5、的信號肽和由43個氨基酸組成的前導(dǎo)肽。經(jīng)氨基酸同源比對發(fā)現(xiàn),大菱鲆cathepsin D與其他物種有高度的同源性,與尖吻鱸(Lates calcarifer)的相似性達(dá)89％。熒光定量表達(dá)分析顯示cathepsin D在肝臟中表達(dá)量最高。受哈維氏弧菌感染后,cathepsin D在肝臟、脾臟和頭腎中的表達(dá)量均在8 h達(dá)到最低。此后,在肝臟和頭腎中cathepsin D的表達(dá)量又逐步上升,并在24h超過了初始表達(dá)量;cathepsin D

6、在脾臟中的表達(dá)量從12h起就高于初始表達(dá)量并維持這一表達(dá)水平至36 h。根據(jù)研究結(jié)果推測cathepsin D可能具有抗原呈遞的作用,而且在感染12 h后可能參與了細(xì)胞的凋亡過程。
　　 2.大菱鲆CXCR4基因的克隆及表達(dá)分析
　　 CXCR4屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員。本研究獲得的大菱鲆CXCR4cDNA全長為1349 bp,編碼372 aa。一級結(jié)構(gòu)分析顯示大菱鲆CXCR4與其他脊椎動物的序列具有高度相似性。大

7、菱鲆CXCR4在脾臟組織中的表達(dá)量最多。感染后,CXCR4在脾臟和頭腎的表達(dá)量分別于8h和12h出現(xiàn)最低值,之后又都逐漸上升直至36 h。
　　 3.大菱鲆Rac1基因的克隆及表達(dá)分析
　　 Rac1是Rho小GTP結(jié)合蛋白家族中的成員。它是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動蛋白的重要信號分子,可以間接地控制細(xì)胞的形態(tài)及運動。本研究獲得了2420bp的大菱鲆Rac1全長cDNA序列,預(yù)測的氨基酸序列與其他Rac亞家族中的成員有高度相似性,

8、與人類Rac1的相似性達(dá)95.3％。熒光定量分析顯示,大菱鲆Rac1在所有組織中都有組成型表達(dá)。免疫感染后,Rac1在肝臟中的表達(dá)較為波動,分別在8 h和24 h出現(xiàn)了兩次上調(diào)表達(dá),在12 h和36 h出現(xiàn)兩次下調(diào)表達(dá)。在頭腎中,Rac1在4 h的表達(dá)出現(xiàn)下降,之后在24 h回升至初始表達(dá)水平。
　　 4.大菱鲆hsc70基因的克隆及表達(dá)分析
　　 大菱鲆HSC70的全長cDNA序列包含一個1956 bp的開放閱讀框。在

9、預(yù)測的651個氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了Dnak特征性基序,胞質(zhì)HSP70特征基序以及四肽簡并重復(fù)序列,而且與其他真核生物HSP70家族成員具有較高同源性。表達(dá)分析顯示,hsc70在大菱鲆各組織中呈組成型表達(dá);受哈維氏弧菌感染后,大菱鲆肝臟和脾臟中的hsc70表達(dá)水平分別在24 h和12 h出現(xiàn)上調(diào)(2.5倍和1.6倍);注射生理鹽水組與未注射組之間差異不顯著。
　　 5.溶藻弧菌溶血素tlh的克隆表達(dá)、蛋白純化及致病性研究
　　

10、 溶血素是許多病原菌的致病因子。本研究克隆表達(dá)了溶藻弧菌溶血素的tlh基因(ORF為1254 bp),其預(yù)測氨基酸序列含有GDSL磷脂酶結(jié)構(gòu)域。將該基因在大腸桿菌中重組表達(dá)后,利用Ni瓊脂糖親和柱進(jìn)行純化,純化蛋白具有磷脂酶活性和溶血活性,其溶血活性為18HU/μg?；钚苑治鲲@示,二價金屬離子對TLH的溶血活性都有不同程度的抑制,而一價金屬離子則不影響其活性。TLH的溶血活性受到蛋白質(zhì)化學(xué)修飾劑的強(qiáng)烈影響。致病性研究顯示,TLH對牙鲆