木霉甘露聚糖酶Man1的基因克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該論文闡述了木霉甘露聚糖酶Man1的克隆及其在畢赤酵母表達(dá)體系中的表達(dá).首先用PCR擴(kuò)增了Man1的全長基因,經(jīng)過酶切論證后,交其插入pPIC9K質(zhì)粒中,構(gòu)建表達(dá)載體.然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.通過菌落PCR驗(yàn)證正向插入子,然后富集培養(yǎng),抽取質(zhì)粒.表達(dá)質(zhì)粒用SacI線形后,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115得到重組菌.Congo Red平板篩選到12株有正常酶活性的表達(dá),在特異底物的平板上有清晰的水解圈,對照GS115則不產(chǎn)生水解圈.通過提取重組

2、菌的總DNA作為模板,以設(shè)計的克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到陽性結(jié)果,用出發(fā)菌株Trichoderma reesei總DNA作為模板得到的克隆片段大小和重組菌結(jié)果一致,而以GS115總DNA作為模板在同樣條件下結(jié)果為陰性,從而確證基因的導(dǎo)入.SDS-PAGE凝膠電泳顯示出該蛋白質(zhì)的大小在45kDa左右.將其cDNA克隆連接到載體中表達(dá),其活性和全長基因克隆的一致,說明酵母細(xì)胞能夠正常剪切該基因內(nèi)部的兩個內(nèi)含子,表達(dá)有正常活性的酶分子.基因工

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