木聚糖酶融合基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、本實(shí)驗(yàn)中，以來源于AspergillususamiiE001的高比活木聚糖酶xynII為親本，將TfxA的前31個(gè)氨基酸連接在xynII的N端，成功地構(gòu)建了融合酶TPL，該酶在大腸桿菌和畢赤酵母中獲得了成功的表達(dá)，其熱穩(wěn)定性比原酶有一定的提高。編碼TfxA的前31個(gè)氨基酸的核酸片段-A段，作為融合基因txl的5’序列；編碼木聚糖酶xynII的成熟肽的核酸片段-B段，作為融合基因txl的3’序列。A段和B段采用重疊延伸法構(gòu)建融合基因txl

2、，將之克隆到載體pTG19-T中，經(jīng)測序得到完全正確的融合基因。 將融合基因txl克隆到表達(dá)載體pET28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-txl，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。融合酶TPL在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，該工程菌在對數(shù)生長中期(OD600為0.6～0.8)，使用終濃度為0.8mmol/L的IPTG在28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5h時(shí)，酶活最高達(dá)2.6

3、7U/mL；SDS-PAGE分析表明TPL融合蛋白分子量大小約為28.5kD。融合酶TPL最適pH為4.5，最適溫度為45℃，和xynTI相差不大，但在熱穩(wěn)定性上有一定的提高，在50℃處理10min，TPL和xynII的殘余酶活分別為15.72％和6.92％。 將融合基因克隆到表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-txl，電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中。融合酶TPL在畢赤酵母GS115中表達(dá)成功，酶活最高達(dá)110.88U