機械力誘導(dǎo)成熟脂肪組織再生機制的實驗研究.pdf

1、大體積軟組織缺損的修復(fù)是整形外科面臨的最大挑戰(zhàn)之一。美國整形外科協(xié)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，201 5年僅全美就有近576萬例修復(fù)重建手術(shù)，76％源于腫瘤切除術(shù)后軟組織缺損的修復(fù)與重建。根據(jù)外科修復(fù)缺損的“replace tissue withlike-tissue”原則，自體脂肪組織被認(rèn)為是最理想的軟組織填充材料，所以自體脂肪移植被廣泛用于美容整形和創(chuàng)傷修復(fù)中。然而，由于移植脂肪存活率只有50％左右，可能需要反復(fù)多次注射移植從而才能達(dá)到比較滿意

2、的遠(yuǎn)期效果。并且脂肪注射移植更適合于部分小體積的軟組織缺損，多數(shù)的大體積軟組織缺損的修復(fù)方案仍為傳統(tǒng)的自體皮瓣或者脂肪瓣移植。這種皮瓣移植術(shù)后都不可避免的造成供區(qū)不可逆的畸形和瘢痕。以及受區(qū)外形的臃腫，需多次手術(shù)修整。這種整形外科傳統(tǒng)的“拆東墻補西墻”的修復(fù)方案遭到日益增多的質(zhì)疑，因此，旨在再生出具有功能的脂肪組織的脂肪組織工程，為大體積軟組織缺損的修復(fù)提供了一條新的途徑。脂肪組織工程包括三個至關(guān)重要的部分:種子細(xì)胞、可降解的支架、以及

3、適當(dāng)?shù)臑榧?xì)胞生長和脂肪形成提供信號的成脂環(huán)境。
　　目的：
　　本實驗先是研究機械力對ASCs增殖、成脂分化能力，以及促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，通過構(gòu)建體外負(fù)壓吸引誘導(dǎo)脂肪組織再生的大鼠模型，觀察吸引作用各個時間點的脂肪組織體積，以及利用H&E染色組織學(xué)、免疫熒光、Real-Time PCR、ELISA等技術(shù)分析機械力誘導(dǎo)脂肪組織再生的過程及其機制，這對于證明單純依靠機械力可誘導(dǎo)脂肪組織再生，實現(xiàn)非侵入性構(gòu)建帶血管蒂的大體脂

4、肪組織的意義重大，為臨床修復(fù)大體積軟組織缺損提供新的思路以及實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、機械力對ASCs增殖能力、成脂分化能力以及促炎癥細(xì)胞因子分泌的影響
　　(1)將機械力作用于ASCs，實驗分組如下:①對照組:無拉伸普通培養(yǎng);②拉伸組:12％、10cycles/min，拉伸培養(yǎng);③細(xì)胞松弛素D組:培養(yǎng)基中加入2μM細(xì)胞松弛素D拉伸培養(yǎng)。拉伸培養(yǎng)48小時后，觀察細(xì)胞形態(tài)、Pholloidin染色細(xì)胞骨架、MTS實

5、驗檢測細(xì)胞增殖能力。
　　(2)以上3組細(xì)胞進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo)，待分化誘導(dǎo)7天后檢測PPARγ基因表達(dá)，12天后分別進(jìn)行油紅O染色，LPL基因表達(dá)的檢測。
　　(3)利用Western Blotting檢測3組ASCs細(xì)胞內(nèi)MIF的表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)基中MIF、IL-6的分泌情況。
　　(4)通過Transwell小室（上室為THP-1誘導(dǎo)形成的巨噬細(xì)胞，下室為3組ASCs細(xì)胞培養(yǎng)基），分析機械力作用下的ASCs分

6、泌的促炎因子對巨噬細(xì)胞遷移能力的影響。
　　(5)統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，顯著性檢驗采用One-Way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、機械力誘導(dǎo)構(gòu)建預(yù)擴(kuò)張脂肪組織
　　(1)將大鼠腹股溝脂肪瓣轉(zhuǎn)位到腹部，待切口愈合后，放置體外負(fù)壓吸引裝置（負(fù)壓值為-25 mmHg，10小時/天）構(gòu)建機械力誘導(dǎo)脂肪組織

7、再生的動物模型。
　　(2)對照組和實驗組分別于吸引后1周、4周、8周、12周，實驗組于12周移除負(fù)壓吸引裝置4周后取材。
　　(3)脂肪組織標(biāo)本進(jìn)行以下檢測:①脂肪組織體積的測量;②H&E染色組織學(xué)分析;③免疫熒光CD31分析血管密度;④免疫熒光CD34和圍脂滴蛋白分析脂肪組織新生;⑤Real-Time PCR分析成脂基因的表達(dá)情況;⑥ELISA檢測脂肪組織IL-1β，IL-6，TNF-α，和MIF的表達(dá)情況。
　　

8、(4)統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。為比較處理因素和時間的相互影響，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了析因分析。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。兩獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、機械力促進(jìn)ASCs增殖，抑制其成脂分化，上調(diào)ASCs分泌促炎癥細(xì)胞因子
　?、偌?xì)胞骨架的變化:在對照組中，ASCs隨機排列，

9、且細(xì)胞骨架也是無規(guī)律的隨機分布。當(dāng)ASCs受到機械力拉伸以后，ASCs細(xì)胞變得細(xì)長，幾乎與機械力作用方向垂直排列，細(xì)胞骨架也重新有規(guī)律的排列，與細(xì)胞排列方向平行。當(dāng)ASCs的培養(yǎng)基中加入了細(xì)胞松弛素D后，可以觀察到ASCs變成圓形，細(xì)胞骨架幾乎完全聚集成簇。
　?、谕ㄟ^MTS實驗，在檢測的48小時和72小時這兩個時間點，我們發(fā)現(xiàn)拉伸組的細(xì)胞增殖率明顯高于其他兩個組P＜0.05，而對照組和細(xì)胞松弛素D組之間無顯著性差異P＞0.05。

10、
　　③油紅O染色:對照組中ASCs被定向成脂分化誘導(dǎo)后第5天開始，包漿內(nèi)出現(xiàn)小的脂滴并逐漸聚集融合成較大的脂滴。細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生明顯的改變，從長梭形類成纖維細(xì)胞外觀逐漸變成不規(guī)則形狀而后變成圓形。成脂分化誘導(dǎo)12天后出現(xiàn)了大量的脂滴，油紅O染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，證明鏡下所見細(xì)胞內(nèi)顆粒確為脂滴。拉伸組中ASCs成脂分化后誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞內(nèi)才開始出現(xiàn)小脂滴，細(xì)胞形態(tài)也會發(fā)生與對照組細(xì)胞相類似的改變，且成脂分化誘導(dǎo)12天后包漿

11、內(nèi)的脂滴也較對照組少。細(xì)胞松弛素D組中ASCs跟對照組一致，也是在定向成脂分化誘導(dǎo)后第5天開始，包漿內(nèi)出現(xiàn)小的脂滴并逐漸聚集融合成較大的脂滴，細(xì)胞形態(tài)也會發(fā)生相類似的改變。成脂分化誘導(dǎo)12天后，油紅O染色陽性，鏡下觀察可見其成脂明顯多于對照組。
　?、躌eal-Time PCR: PPARγ和LPL基因水平在拉伸組中表達(dá)最低。無論是在成脂分化過程的早期還是后期，細(xì)胞松弛素D組的成脂系基因表達(dá)始終高于其他兩組，而拉伸組的成脂系基因表

12、達(dá)更是低于對照組。
　?、菁?xì)胞內(nèi)外MIF表達(dá)情況:通過Western blotting檢測ASCs細(xì)胞內(nèi)MIF的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)拉伸組的表達(dá)量是三組中最高的P＜0.05，大約是對照組的3倍。而拉伸+細(xì)胞松弛素D組，雖然細(xì)胞內(nèi)MIF表達(dá)量比拉伸組有很大程度的降低（相對表達(dá)量只有拉伸組的一半左右），但是仍然高于對照組，P＜0.05。ASCs培養(yǎng)基中MIF的表達(dá)水平則通過ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)MIF在3組的表達(dá)情況跟ASCs細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況

13、類似。拉伸組的表達(dá)量仍然是三組中最高的P＜0.05，而拉伸+細(xì)胞松弛素D組，雖然表達(dá)量比拉伸組低但是仍然高于對照組P＜0.05。
　　2、機械力誘導(dǎo)成熟脂肪組織再生
　?、僦景牦w積變化:統(tǒng)計學(xué)分析顯示對照組脂肪瓣體積隨時間增加變化不明顯，而實驗組在第4周后體積隨時間增加而明顯增長，在第8周和第12周實驗組脂肪瓣體積顯著大于對照組P＜0.05。實驗組在負(fù)壓外吸引12周后去除負(fù)壓吸引裝置，4周后（16周）脂肪瓣體積與12周時比

14、較出現(xiàn)輕度回縮P＜0.05。
　?、贖&E染色組織學(xué)分析:兩組各個時間點脂肪瓣組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常脂肪組織無明顯差異。未發(fā)現(xiàn)明顯的水腫等征象，是因為不是吸引后即刻取材，而是在撤除負(fù)壓吸引裝置后24小時取材。但是在實驗組中，可以觀察到比對照組多很多的血管，但是在撤除負(fù)壓吸引裝置以后4周，脂肪瓣中的血管數(shù)量也明顯減少，恢復(fù)到對照組水平。
　?、垩苊芏?CD31陽性細(xì)胞計數(shù)血管數(shù)目，吸引組脂肪組織中血管密度從4周到12周一直高于對照

15、組P＜0.05，當(dāng)去除外吸引裝置以后4周，吸引組脂肪組織中血管密度與對照組無明顯差異。
　?、芗?xì)胞增殖:在吸引后4周時，吸引組脂肪瓣中的細(xì)胞有明顯增殖(Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量增多)，且部分Ki67陽性的細(xì)胞CD34染色也呈陽性，說明增殖的細(xì)胞中有干細(xì)胞，也可能有其他類型的細(xì)胞。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在吸引1周和4周時，吸引組中CD34+/Ki67+細(xì)胞數(shù)量顯著增多，到8周和12周出現(xiàn)下降，但一直都高于對照組P＜0.05，當(dāng)去除吸引裝置后，

16、吸引組的CD34+/Ki67+細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到對照組水平。
　?、莩芍虻谋磉_(dá):Real-Time PCR檢測成脂基因PPARγ和CEBP的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)吸引組中成脂基因一直處于高表達(dá)的狀態(tài)P＜0.05，但是當(dāng)去除引裝置以后4周，其表達(dá)量恢復(fù)到正常水平，與對照組無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.機械拉力可促進(jìn)ASCs增殖，但抑制其成脂分化，這種效應(yīng)與機械力導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重排密切相關(guān)，且會因細(xì)胞骨架的排列

17、被打亂、解聚合（細(xì)胞松弛素D作用后）而抵消。
　　2.機械拉力可促進(jìn)ASCs分泌促炎癥細(xì)胞因子（MIF和IL-6），促炎癥因子表達(dá)的升高調(diào)控巨噬細(xì)胞的遷移。
　　3.負(fù)壓吸引產(chǎn)生機械力在脂肪組織再生的早期，通過使細(xì)胞骨架重排，促進(jìn)ASCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，為后期的成脂分化提供足夠的細(xì)胞來源和良好的血供條件。到后期，細(xì)胞增殖達(dá)到頂峰的時候，脂肪組織大量分泌的MIF開始發(fā)揮其促進(jìn)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)成脂分化的作用，由此成熟脂肪組織實