慢性腎衰大鼠脂肪組織RAS活化對脂肪組織巨噬細胞表型改變的影響及機制.pdf

1、研究背景：
　　 慢性腎臟病(CKD)在全世界越來越多，終末期腎病患者，尤其是接受透析治療的患者死亡率與同齡正常人相比顯著增加。根據(jù)美國全國健康與營養(yǎng)評估調(diào)查(NHANES)的數(shù)據(jù)來看，在1999-2004年這段時間內(nèi)美國的CKD（不包括終末期CKD）患病率已經(jīng)達到13.1％，而同時段內(nèi)澳大利亞、中國、印度患者按CKD分期，第3期到第5期的患病率大約為5％。慢性腎臟病患者，尤其是終末期腎病需要透析治療或者腎移植的患者，即使移植物

2、功能在正常范圍內(nèi)，其罹患心血管疾病的風險也顯著增加。慢性腎功能不全患者全身炎癥反應(yīng)增強并通常伴隨著胰島素敏感性降低，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率和死亡率都增加。
　　 幾乎所有的腎臟病都伴隨著由炎癥因子分泌和免疫細胞浸潤引起的腎臟炎癥。RAS一直是公認的全身血壓和腎臟水電解質(zhì)平衡的重要調(diào)節(jié)器[3]，RAS的主效應(yīng)器AngⅡ在高血壓病血管重構(gòu)中是主要介質(zhì)之一。除了作為強效的血管收縮劑，AngⅡ還能通過激活氧化還原途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)誘導(dǎo)整

3、合素蛋白、粘附分子、細胞因子、生長因子、促纖維化介質(zhì)，引起活性氧的釋放增加，并且增加NF-κB的核轉(zhuǎn)位，降低內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)的活性，從而起促進炎癥的作用。這些促炎癥效應(yīng)可以被ARB阻斷。RAS在高血壓病與心血管疾病(CVD)的發(fā)生發(fā)展和病理生理中起關(guān)鍵作用。
　　 脂肪組織功能正常對人類健康來說是必不可少的，它作為禁食時的能量來源并為體溫調(diào)節(jié)提供隔熱條件，過去人們一直認為脂肪細胞只是一個不活躍的能量來源，但是最近越來

4、越多研究表明脂肪細胞合成并分泌大量促炎癥因子如細胞因子、急性期反應(yīng)蛋白、趨化因子、類花生酸、前列腺素和抗炎細胞因子如脂聯(lián)素、IL-10?？傊?，這些脂肪細胞來源的因子被稱為脂肪因子。脂肪因子在過去數(shù)年里一直在增加，現(xiàn)在已知的由脂肪細胞分泌的脂肪因子有50多種[5]。脂肪組織由脂肪細胞(30％-50％)和前脂肪細胞、纖維母細胞、血管與免疫細胞（單核/巨噬細胞、淋巴細胞）組成。多肽類脂肪因子（如脂聯(lián)素、瘦素。內(nèi)脂肪素）由脂肪細胞分泌，細胞因子

5、(MCP-1、巨噬細胞炎癥蛋白、TNF-α、ILs1β、6、8、10等)由血管基質(zhì)類細胞分泌，然而這兩者間也有重疊，因為有的脂肪因子同時由脂肪細胞和血管基質(zhì)類細胞分泌(如抵抗素和apelin)[9]。巨噬細胞浸潤是慢性腎臟病和肥胖的一個共同特征，但是巨噬細胞在功能上具有明顯的異質(zhì)性。最近研究表明，巨噬細胞可以按功能不同分為兩種不同的極性狀態(tài):M1型即“經(jīng)典活化型”巨噬細胞和M2型“轉(zhuǎn)化型”巨噬細胞。M1型巨噬細胞由經(jīng)典的免疫途徑誘導(dǎo)激活

6、(如LPS和IFN-γ)，并能促進炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1β、IL-6等。M2型巨噬細胞可由IL-4和IL-13刺激產(chǎn)生。M2型巨噬細胞通過合成抗炎細胞因子IL-10和IL-1誘導(dǎo)性受體及內(nèi)吞清除作用在炎癥消退和組織修復(fù)中起重要作用。抑制巨噬細胞炎癥因子的表達在慢性炎癥模型中對腎臟損傷具有保護作用。M1型巨噬細胞與M2型巨噬細胞在體內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。
　　 長期以來，人們認為RAS僅調(diào)節(jié)著收縮壓和腎臟電解質(zhì)的平衡

7、，但近十年研究發(fā)現(xiàn)，腎素—血管緊張素系統(tǒng)的多種成分也表達于多種組織中，如:腎上腺、腎臟、腦、心臟和血管中，并在各臟器局部發(fā)揮著重要作用。隨著肥胖和代謝綜合征的發(fā)生率增加，RAS在脂肪組織的表達和局部作用也受到了重視。大量研究已證實，人和鼠的脂肪細胞中均表達血管緊張素原(AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素受體1(AT1)和2(AT2)。簡要地說，肝臟合成并釋放血管緊張素原(AGT)至循環(huán)血液中，腎小球的球旁器中顆粒細胞分泌腎

8、素，腎素催化血管緊張素原生成AngⅠ，AngⅠ進一步由肺毛細血管上皮細胞分泌的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)催化生成AngⅡ，即RAS的主要活性成分，AngⅡ通過與兩種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白AT1R和AT2R發(fā)揮生物學(xué)活性[18]。AngⅡ大部分生理功能通過與AT1R結(jié)合而產(chǎn)生。局部AngⅡ抑制前脂肪細胞的分化，減少脂肪細胞的數(shù)量，促進脂肪細胞的肥大;血管緊張素Ⅱ還促進炎癥因子的釋放，引起脂肪組織炎癥反應(yīng)。有研究證實，在過表達AGT的小鼠脂肪組織中血

9、管生成因子與炎癥因子表達增加，從而引起局部胰島素抵抗與脂肪組織血管重構(gòu)（血管生成），并且循環(huán)中免疫細胞的浸潤阻止前脂肪細胞分化，進一步介導(dǎo)血管收縮。AngⅡ通過活化NF-κB信號通路促進成熟脂肪細胞和前脂肪細胞促炎癥因子釋放，并且AngⅡ能作用于脂肪組織基質(zhì)血管細胞，如單核細胞、巨噬細胞、T細胞發(fā)揮作用，而這些細胞都能表達RAS組分。因此，脂肪組織RAS的活化可引起脂肪局部和機體全身的炎癥反應(yīng)。
　　 之前已經(jīng)有研究證實在慢性腎

10、衰大鼠脂肪組織內(nèi)存在炎癥反應(yīng)并有RAS活化，但是這兩者之間是否有聯(lián)系尚不清楚，本實驗旨在證實慢性腎衰時脂肪組織RAS活化對巨噬細胞表型的影響，并探討其可能的機制。在體內(nèi)用5/6腎切除大鼠作為慢性腎功能衰竭模型，觀察RAS活化對脂肪組織炎癥與巨噬細胞極性的影響，體外實驗則用LPS或mIL-4加AngⅡ刺激RAW264.7巨噬細胞觀察AngⅡ?qū)奘杉毎麡O性的影響。
　　 研究方法：
　　 體內(nèi)部分
　　 一、二步法5

11、/6腎切除建立慢性腎衰模型
　　 1)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位固定于鼠臺上。
　　 2)酒精消毒，于大鼠左腹部中1/3脊柱旁開2-3cm處行縱行切口，切口長度約為2-3cm。
　　 3)依次切開皮膚和皮下組織，并剪開肌肉暴露腎臟，剝離腎包膜，用無損傷血管鉗夾住腎蒂，切除腎臟的上下極約占左腎的2/3，明膠海綿壓緊上下極創(chuàng)面止血，放松血管鉗，觀察創(chuàng)面不再滲血后還納腎臟回腹腔，逐層縫合

12、肌層及皮膚，酒精消毒手術(shù)切口?？p合前，腹腔內(nèi)滴注青霉素注射液，預(yù)防感染。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 4)一周后，在脊柱右側(cè)中1/3旁開2-3cm縱行切口（切口略高于左側(cè)），分離肌層，游離腎臟，無損傷血管鉗夾住腎蒂，4號絲線結(jié)扎腎蒂，切除右側(cè)腎臟，觀察有無出血，縫合肌層和皮膚，酒精消毒手術(shù)切口。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。
　　 二、大鼠RAS阻斷劑ARB（替米沙坦）刺激5/6腎切除術(shù)后第12周，將慢性腎衰大鼠隨機分為

13、3組，第一組不作任何處理，第二組給予替米沙坦15mg/kg/d灌胃，第三組給予肼屈嗪20mg/kg/d灌胃，時間為4周。大鼠處死前兩天測鼠尾動脈血壓。
　　 三、大鼠血、尿和脂肪組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第16周，測定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時尿，并測定24小時尿量與尿肌酐濃度。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺上。
　　 3)腹主動脈采

14、血后，采用放血法處死大鼠，測定血肌酐濃度。
　　 4)酒精消毒皮膚，分離附睪和腹膜后脂肪墊（內(nèi)臟脂肪）及腹股溝脂肪墊（皮下脂肪），迅速放入盛有1×PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿中。
　　 5)PBS反復(fù)清洗脂肪墊，剔除肉眼可見的血管，將脂肪墊剪成小塊，包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 四、脂肪組織炎癥指標NF-κB的檢測以及STAT1/3與SOCS1/3的表達Sham組、CRF組、CRF加替米沙坦組、C

15、RF加肼屈嗪組大鼠皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織，按組織重量∶裂解液=1∶4的比例用勻漿器反復(fù)上下勻漿，以上操作均在冰上進行，勻漿完全后，13000g，4℃離心40min，去掉漂浮于上層的脂滴，提取中間層的勻漿液，即為脂肪組織的總蛋白，加入SDS(5×)上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白，Western Blotting檢測脂肪組織NF-κβ亞基p-P65、P65、STAT1/3、p-STAT1/3、SOCS1/3的表達。
　　 五、rea

16、l-time PCR檢測皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪組織炎癥因子和巨噬細胞表面標記物的表達Sham組、CRF組、CRF加替米沙坦組、CRF加肼屈嗪組大鼠皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織液氮砸碎，按組織重量∶TRIZOL=1∶10的比例勻漿，提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測IL-6、MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β、Arg1、CD206、dectin的mRNA表達。
　　 六、統(tǒng)計方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重

17、復(fù)實驗的結(jié)果，以均數(shù)±標準差表示，所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。多個樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 體外部分
　　 一、RAW264.7巨噬細胞的培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞采用美國ATCC細胞株。復(fù)蘇后在37℃，5％CO2，10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代。細胞狀態(tài)良好時接種于培養(yǎng)板，每48小時換一次液，待細胞生長

18、至融合后，換用不含F(xiàn)BS的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，使細胞處于同步生長狀態(tài)，然后用于實驗。
　　 二、AngⅡ?qū)PS、IL-4誘導(dǎo)巨噬細胞極化的影響（時間、濃度效應(yīng)）
　　 巨噬細胞分別與0.01、1、10umol/L AngⅡ或10ng/mL LPS、100ng/mL mIL-4同孵育16、20、24小時，并且在濃度和時間最高點加替米沙坦刺激，收集細胞提取RNA，qRT-PCR檢測IL-1β、CD11c、iNOS、Ar

19、g1、CD206、dectin的mRNA表達。
　　 結(jié)果：
　　 體內(nèi)部分
　　 一、腎衰大鼠模型的確立在二步法5/6腎切除術(shù)后的第16周，采集大鼠尿液和血液測定血肌酐和肌酐清除率。在第16周時，慢性腎衰組大鼠體重和肌酐清除率與假手術(shù)組相比顯著減少(P＜0.05)，而血肌酐和血壓水平顯著升高(P＜0.001)。
　　 二、慢性腎衰對脂肪組織炎癥和巨噬細胞極性的影響
　　 1、慢性腎衰促進皮下脂肪

20、IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達與NF-κB P65亞基磷酸化水平，抑制Arg1、CD206、dectin mRNA表達CRF組皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達與Sham組相比顯著增加(IL-6:P=0.001;:TNF-α:P=0.029; MCP-1:P＜0.001;IL-1β:P＜0.001;iNOS:P＜0.001);而Arg1、CD206、de

21、ctin mRNA表達量則比Sham組明顯減少（Arg1:P=0.001; CD206:P=0.001;dectin:P＜0.001）。NF-κB P65磷酸化水平與Sham組相比顯著增強(P=0.002)。CRF組SOCS1的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P＜0.001)，STAT1的磷酸化水平比Sham組明顯增強(P=0.001)，STAT3的磷酸化水平比Sham組

22、明顯增強(P＜0.001)。
　　 2、慢性腎衰促進內(nèi)臟脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達與NF-κB P65亞基磷酸化水，抑制Arg1、CD206、dectin mRNA表達CRF組內(nèi)臟脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1β mRNA的表達與Sham組相比顯著增加(IL-6:P=0.004; TNF-α:P=0.023);MCP-1:P=0.016;iNOS:P＜0.

23、001; IL-1β:P=0.001）;而Arg1、CD206、dectin mRNA的表達量則比Sham組明顯減少（Arg1:P＜0.001;CD206:P=0.006; dectin:P＜0.001）。NF-κB P65的磷酸化水平與Sham組相比顯著增強(P=0.032);SOCS1的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平與Sham組相比明顯減弱(P=0.004)，STAT1的磷酸化水平比Sham

24、組明顯增強(P=0.001)，STAT3的磷酸化水平比Sham組明顯增強（P=0.031）。
　　 3、替米沙坦抑制慢性腎衰皮下脂肪炎癥并改變巨噬細胞積極性CRF+替米沙坦組皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表達與CRF組相比顯著減弱(IL-6: P=0.002:; TNF-α: P=0.008; MCP-1:P＜0.001; IL-1β: P＜0.001; iNOS: P＜0.001)，而

25、Arg1、CD206、dectin mRNA的表達量則比CRF組明顯增強(Arg1: P＜0.001; CD206-P＜0.001; dectin:P=0.003)，NF-κB P65的磷酸化水平與CRF組相比顯著減弱(P=0.001);SOCS1的蛋白水平比CRF組明顯增強(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平比CRF組明顯增強(P=0.001):STAT1/3磷酸化水平與CRF紅相比明顯減弱(P＜0.001)。
　　 4、

26、替米沙坦抑制慢性腎衰內(nèi)臟脂肪炎癥并改變巨噬細胞極性CRF+替米沙坦組內(nèi)臟脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表達與CRF組相比顯著減弱(IL-6: P=0.006:; TNF-α: P=0.013; MCP-1:P=0.006; IL-1β: P=0.005; iNOS: P＜0.001)，而Arg1、CD206、dectin mRNA的表達量則比CRF組明顯增強(Arg1: P=0.049; CD206

27、: P=0.006; dectin:P=0.038)，NF-κB P65的磷酸化水平與CRF組相比顯著減弱(P=0.031);SOCS1的蛋白水平比CRF組明顯增強(P＜0.001)，SOCS3的蛋白水平比CRF組明顯增強(P=0.007);STAT1磷酸化水平與CRF組相比明顯減弱(P=0.001)，STAT3磷酸化水平與CRF組相比明顯減弱(P=0.029)。
　　 5、慢性腎衰對巨噬細胞極性的影響M1/M2型巨噬細胞比率以

28、IL-1β/CD206表示，CRF組M1/M2與假手術(shù)組相比顯著性升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 慢性腎衰時脂肪組織存在炎癥反應(yīng)，替米沙坦抑制大鼠脂肪組織炎癥并通過抑制SOCS1/3的表達、增加STAT1/3的磷酸化，從而促使巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換。
　　 體外部分
　　 AngⅡ?qū)PS與mIL-4誘導(dǎo)的巨噬細胞極化的影響AngⅡ以劑量依賴的方式上調(diào)LPS刺激后的巨噬細胞（RAW264

29、.7細胞）IL-1β、CD11c、iNOS mRNA的表達，并在10umol/L時達最高(IL-1β: F=168.363，P＜0.001, CD11c: F=23.389, P＜0.001, iNOS: F=60.192, P＜0.001)，抑制mIL-4刺激后的Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(Arg1:F=66.05，P＜0.001，CD206:F=35.013; P＜0.001; dectin: F=42.03

30、2，P＜0.001);同時AngⅡ以時間依賴的方式上調(diào)LPS刺激后的巨噬細胞IL-1β、CD11c、iNOS mRNA的表達，刺激24小時IL-1β、CD11c、iNOS mRNA的表達最高(IL-1β: F=116.085，P＜0.001，CD11c: F=61.221，P＜0.001，iNOS: F=36.728，P＜0.001)，抑制mIL-4刺激后的Arg1、CD206、dectin mRNA的表達(Arg1:F=148.706