bFGF和PDGF-BB作用內(nèi)皮祖細胞促進血管形成及相關信號分子的研究.pdf

1、前言:內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，即能循環(huán)、增殖并分化為成熟血管內(nèi)皮細胞。自從1997年Asahara等首次從成人外周血中分離出EPCs，并證實EPCs在生后的生理性和病理性血管新生中發(fā)揮重要作用以來。EPCs介導的缺血組織血管再生(即治療性血管新生)的研究已取得了較大的進展。
　　 正常情況下，骨髓中EPCs處于休眠狀態(tài)，細胞因子可以促進EPCs動員

2、、遷移和分化并參與新血管形成。EPCS的多向分化潛能是其最重要的生物學特征，EPCs具體向哪個方向分化及其調(diào)控機制是目前研究的熱點。以往認為，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞來源于不同的前體細胞，但最近Yamashita和Lino等人的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞可以來自同一前體細胞。而且有人在體內(nèi)外的血管形成研究中發(fā)現(xiàn)，成熟的內(nèi)皮細胞可以轉(zhuǎn)分化為血管平滑肌細胞。因此，這些均可為研究EPCs的平滑肌分化潛能奠定一定的理論基礎。
　　 EP

3、Cs的分化受多種因素的影響，如缺氧、生長因子等，然后通過復雜的信號通路調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種基因的表達，最終引起EPCs的不同方向分化。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)主要通過對內(nèi)皮細胞的直接絲裂原作用促進新生血管的形成。PDGF-BB是目前研究其在血管形成和穩(wěn)定方面比較熱點的一種生長因子，Betsholtz將PDGF-B和PDGFR-β基因敲出后發(fā)現(xiàn)：新形成的血管缺乏周細胞/平滑肌細胞募集，這也說明PDGF-BB

4、是血管成熟的重要因子。
　　 目前人們就治療性血管新生進行了廣泛的研究，但是許多研究還只是注重新生血管形成的多少而忽略了新形成血管的成熟性和穩(wěn)定性。一個成熟、功能血管網(wǎng)的形成需要內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的相互作用，因為內(nèi)皮細胞只能啟動血管形成過程，但不能完善新形成的血管，如果要想使新生血管成熟，則必須要有平滑肌/周細胞的參與。因此，如果能分離出既能分化為內(nèi)皮細胞又能分化為平滑肌細胞潛能的干/祖細胞，同時這種干/祖細胞源性的內(nèi)皮細胞和

5、平滑肌細胞又具有明顯的增殖、遷移能力，這將為功能血管網(wǎng)的形成奠定雄厚的基礎。
　　 內(nèi)皮祖細胞可以分化為內(nèi)皮細胞并參與在治療性血管生成中，這一現(xiàn)象早已被許多實驗所證實。通常生長因子與細胞表面的受體結合后，可以激活其下游分子而發(fā)揮促細胞分化、增殖等作用。磷脂酶C-γ(PLC-γ)是生長因子信號通路的一個重要信號中介，可被生長因子酪氨酸受體所激活，細胞外生長因子調(diào)節(jié)細胞生長和分化主要通過其受體的酪氨酸激酶被活化而發(fā)揮作用的。通常人們

6、認為PLC-γ是一個與細胞增殖和分化有重要關系的分子。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細胞發(fā)揮功能的重要信號轉(zhuǎn)導通路。真核細胞中，已確定出ERK(p42/p44MAPK)，JNK/SAPK，p38MAPK及ERK5四條MAPK信號轉(zhuǎn)導通路。其中JNK和p38MAPK兩條通路主要與細胞的應激和凋亡有關，而在細胞信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡中處于樞紐地位的ERK通路主要與細胞的增殖和分化密切相關。
　　 基于EPCs的多向分化潛能以及bFGF和

7、PDGF-BB在體內(nèi)穩(wěn)定新形成血管的作用，本研究假設在bFGF和PDGF-BB分別誘導下，大鼠骨髓EPCs能向血管內(nèi)皮樣細胞和平滑肌樣細胞分化并參與成熟功能血管網(wǎng)的形成；同時通過檢測這二種細胞的增殖、遷移和形成血管的能力明確其能否成為新血管形成的種子細胞。此外，探究bFGF和PDGF-BB介導內(nèi)皮祖細胞分化、增殖的相關信號分子的表達，為闡明內(nèi)皮祖細胞的多向分化機制奠定堅實的理論基礎。
　　 方法:
　　 1、大鼠內(nèi)皮祖細

8、胞分離、培養(yǎng)及鑒定采用Ficoll密度梯度離心法結合差速貼壁篩選法從大鼠骨髓分離EPCs；收集培養(yǎng)5d的EPCs，經(jīng)免疫熒光染色，AC133和vWF雙染陽性細胞為正在分化的EPCs。
　　 2、EPCs的誘導培養(yǎng)及形態(tài)觀察EPCs被培養(yǎng)5天后，進行分組，對照組僅給20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；bFGF組在20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中添加bFGF(30ng/ml)；PDGF-BB組在20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中添加PDG

9、F-BB(40ng/ml)。共培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間每2-3天換液并補充相應生長因子。每天觀察細胞形態(tài)變化并采集圖像。
　　 3、免疫熒光檢測EPCs分化標記物EPCs在置有玻片的24孔板內(nèi)被誘導到第4天和第8天時，換無血清培養(yǎng)基孵育24h后，取出玻片，經(jīng)4％多聚甲醛固定，5％BSA.封閉后加入一抗，4℃過夜，加入FITC、PE和TRITC分別標記的相應二抗，37℃孵育，封片，熒光顯微鏡觀察、采集圖像并進行熒光強度分析。
　

10、　 4、Westerll Blotting檢測EPCs分化相關蛋白表達取EPCs被誘導到第4天和第8天時的細胞進行檢測：各組細胞進行蛋白質(zhì)提取后，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲茲饪s膠及分離膠，上樣后電泳2.5h，PVDF轉(zhuǎn)膜1-2.5h，5％脫脂奶粉封閉1.5h，加一抗(1:200)，4℃過夜，二抗(1:1000)室溫孵育1h，DAB染色，測定灰度值。
　　 5、透射電子顯微鏡檢測分化后EPCs的超微結構被誘導至14天的各組細胞經(jīng)消化

11、，離心(1000rmp，10min)，收集細胞后用2.5％戊二醛在4℃固定60 min，漂洗后再用1％OSO4固定90min，置梯度丙酮中逐級脫水、媒浸、包埋、聚合、切片，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)超微結構變化。
　　 6、流式細胞儀分析分化細胞百分率用0.125％胰蛋白酶消化各組細胞，終止消化，將細胞懸液離心(1000rpm.5min)，棄上清；用0.5％BSA-PBS漂洗再離心，收集入1.5ml

12、 EP管；向bFGF組細胞內(nèi)加入vWF抗體，向PDGF-BB組細胞內(nèi)加入α-SMA抗體，對照組內(nèi)同時加入vWF和α-SMA抗體，37℃，40min；0.5％BSA-PBS漂洗，再向各組加入相應FTTC標記及PE標記二抗，37℃，20min，并設同型對照；重懸細胞，流式細胞儀檢測。
　　 7、內(nèi)皮樣和平滑肌樣細胞活力檢測
　　 (1)MTT法檢測被誘導細胞增殖活性消化收集各組細胞；以5×103/孔的細胞數(shù)接種于96孔板中，

13、每孔體積200μl；放入37℃、5％CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2h；待細胞基本融合，加入3％血清DMEM作用24h；分組：①時間依賴組：內(nèi)皮樣細胞中加入bFGF(10ng/ml)、平滑肌樣細胞中加入PDGF-BB(15ng/ml)并設立相應對照組，分別作用0h、6h、12h、24h，48h；②濃度依賴組：內(nèi)皮樣細胞中按0、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml和16ng/ml濃度梯度加入bFGF；平滑肌樣細胞中按0、3ng/ml、6ng/m

14、l、9ng/ml和18ng/ml加入PDGF-BB，作用24小時，每個實驗組設5個平行孔；檢測時，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)孵育4h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入150μlDMSO，微量振蕩器震蕩10min，置酶標儀測定OD490值。
　　 (2)內(nèi)皮樣和平滑肌樣細胞遷移的檢測消化各組細胞，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液；以5×104/小室的細胞數(shù)加入Transwell小室的上室，體積200μl，將600μ

15、l無血清DMEM加入Transwell小室的下室，并按(1)中的分組加入bFGF和PDGF-BB；每組設3個復孔。檢測時，吸除上室培養(yǎng)液，PBS沖洗，用棉簽擦拭膜上表面未遷移的細胞；甲醇固定膜，吉姆薩染色；將膜切下，用中性樹膠封固于載玻片上；光學顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)遷移的細胞數(shù)。
　　 (3)內(nèi)皮樣和平滑肌樣細胞形成管腔的檢測將Matrigel膠置于4℃冰箱過夜，使之凍融；預冷的24孔板加入Matrigel150μL/孔

16、，37℃孵育1h備用；消化各組細胞，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液；以5～6×105/ml的細胞數(shù)接種細胞于涂有Matrigel的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24-48h。共分四組：①只接種內(nèi)皮樣細胞；②只接種平滑肌樣細胞：③在內(nèi)皮樣(未標記的)形成的管腔中加入平滑肌樣細胞(未標記的)共同接種；④將預先用PKH26標記(紅色)的內(nèi)皮樣細胞和PKH67標記的平滑肌樣細胞(綠色)以3:1的比例(4.5×105/ml：1.5×105/ml

17、)混合接種。在100倍倒置熒光相差顯微鏡下觀察并采集圖像。
　　 8、Real-time PCR檢測bFGF和PDGF-BB作用EPCs后PDGFRβmRNA表達將培養(yǎng)5天的EPCs，靜止12h，再分別用bFGF和PDGF-BB作用30min、60min、90min和180min，進行RNA抽提并測定OD260/OD280，反轉(zhuǎn)錄后按下列條件在熒光定量PCR儀上擴增：95℃，90sec，1個循環(huán)；95℃，5sec、58℃，30s

18、ec和72℃，4min，45個循環(huán)。最后計算mRNA的相對表達量。每個樣本設3個復孔。
　　 9、Western Blot檢測EPCs分化相關的PLC-γ和p-ERK的表達將培養(yǎng)5天的EPCs，靜止12小時，再分別用bFGF和PDGF-BB作用30min、60min和90min，檢測PLC-γ和p-ERK的表達。細胞蛋白質(zhì)的提取、濃度測定、電泳及轉(zhuǎn)印如上文十、ELISA檢測bFGF和PDGF-BB作用EPCs后VEGF的分泌將培

19、養(yǎng)5天的EPCs，靜止12小時，再分別用bFGF(10ng/ml)和PDGF-BB(15ng/ml)作用4h、8h和12h后收集各組細胞培養(yǎng)上清并離心去沉淀(30分鐘，2500轉(zhuǎn)/分鐘)，收集上清保存于-20℃。按試劑盒說明書按步驟進行，根據(jù)標準曲線的直線回歸方程計算出樣品濃度。
　　 結果:
　　 1、內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)、鑒定原代培養(yǎng)24h后，細胞大部分呈小圓形；差速貼壁篩選后，培養(yǎng)一天可見少量細胞貼壁；第2天即可觀察到多

20、且大小相對均一的圓形貼壁細胞，陸續(xù)可見從細胞一側(cè)伸出芽狀突起并逐漸伸展成梭形或紡錘形，第5天時呈“鋪路石”樣排列。在第5天采用免疫熒光進行CD133+vWF雙標染色，細胞同時表達CD133和vWF，即被培養(yǎng)的細胞表達特異性干細胞抗原和內(nèi)皮細胞抗原，表明其為EPCs。
　　 2、EPCs經(jīng)bFGF和PBGF-BB誘導后其形態(tài)學變化在EPCs被誘導4天后，對照組細胞顯示長的芽狀突起；FICs呈現(xiàn)鋪路石的表面；PICs形成梭形外觀，且

21、有呈束狀排列的趨勢。在8天后，NICs形成多個突起，而FICs顯示短梭形；PICs形成“峰與谷”的排列。
　　 3、免疫熒光檢測EPCs在bFGF和PBGF-BB誘導下標記物的變化與NICs相比，F(xiàn)ICs在第4天和第8天都有明顯的內(nèi)皮標記物(PECAM-1，vWF)熒光染色，而且第8天與第4天比，F(xiàn)ICs的熒光強度更加明顯；PICs在第4天和第8天都顯示明顯的平滑肌細胞(α-SMA，calponin)熒光染色，尤其在第8天，PI

22、Cs顯示了較強的平滑肌細胞標記物的表達；NICs對平滑肌細胞標記物和內(nèi)皮細胞標記物(除PECAM-1外)表達一直是陰性的。
　　 4、bFGF和PBGF-BB作用EPCs后，其分化相關蛋白的表達當細胞被誘導到第4天時，仍然有CD133的表達，但到第8天時，CD133的表達消失，這說明被誘導的細胞已經(jīng)失去干/祖細胞的標記。對FICs而言，誘導前和誘導后都有PECAM-1的表達，但誘導后尤其是達到8天時，PECAM-1表達明顯增強。

23、同樣對PICs來說，也逐漸顯示出平滑肌細胞靶向蛋白α-SMA和calponin的表達，即與誘導前比，誘導至第4天時就有α-SMA和calponin的表達；誘導至第8天時，α-SMA和calponin的表達更加明顯。
　　 5、EPCs分化后超微結構變化與誘導前EPCs相比，F(xiàn)ICs和PICs內(nèi)細胞器結構發(fā)達，尤其是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體。但在FICs和PICs內(nèi)并未見到Weibel-Palade小體和肌絲及密體結構。

24、>　　 6、bFGF和PDGF-BB分別誘導EPCs后，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞標記物陽性的細胞百分率EPCs經(jīng)bFGF作用后，具有內(nèi)皮細胞標記vWF的細胞可達72.83％；而EPCs經(jīng)PDGF-BB作用后，具有平滑肌細胞標記α-SMA的細胞可達68.36％，但在對照組中具有上述兩種標記的細胞僅僅2％。
　　 7、bFGF和PDGF-BB分別對內(nèi)皮樣細胞和平滑肌樣細胞影響
　　 (1)內(nèi)皮樣細胞和平滑肌樣細胞增殖的能力相同

25、濃度下，在0-48h期間，bFGF促進內(nèi)皮樣細胞和PDGF-BB促進平滑肌樣細胞增殖的作用隨時間延長而明顯增強，并具有時間依賴性，同時也看到：bFGF和PDGF-BB在小劑量(相對于促進EPCs分化時的劑量而言)時就能促進上述2種細胞的增殖并且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，但bFGF在16ng/ml、PDGF-BB在18ng/ml時增殖達高峰。
　　 (2)內(nèi)皮樣細胞和平滑肌樣細胞遷移的能力相同濃度下，在0-48h期間，bFGF促進

26、內(nèi)皮樣細胞和PDGF-BB促進平滑肌樣細胞遷移的作用隨時間延長而顯著增加，并具有時間依賴性；同時也看到：在小劑量bFGF(2ng/ml)和PDGF-BB(3ng/ml)(相對于促進EPCs分化時的劑量而言)時就能促進上述2種細胞的遷移，并且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性(三)內(nèi)皮樣細胞和平滑肌樣細胞參與管腔形成的能力結果顯示：內(nèi)皮樣細胞伸長并形成管腔，而平滑肌樣細胞則呈彌漫排列，但將上述2種細胞混合接種后，則呈現(xiàn)明顯的管腔形成。為了充分證明參

27、與形成管腔的細胞及管腔的結構，將已標記的內(nèi)皮樣細胞和標記的平滑肌樣細胞共同接種，結果發(fā)現(xiàn)：平滑肌樣細胞與內(nèi)皮樣細胞形成了共同的血管網(wǎng)。
　　 8、bFGF和PDGF-BB作用EPCs后PDGFRβmRNA表達bFGF和PDGF-BB作用EPCs后都會有PDGFRβmRNA的表達。bFGF作用組：PDGFRβmRNA在各時間點均有表達且與對照組比均有顯著差異，當bFGF作用60min時表達量開始明顯增加，且在180min時最顯著。

28、PDGF-BB作用組：PDGFRβmRNA在各時間點也均有表達，與對照組比較，PDGFRβmRNA表達的差異具有統(tǒng)計學意義，相鄰時間點的進行比較差異均也比較顯著。
　　 9、EPCs分化相關的PLC-γ和p-ERK表達Western blot法檢測bFGF和PDGF-BB分別作用EPCs30min、60min和90min后PLC-γ和p-ERK的表達。結果顯示，bFGF和PDGF-BB作用EPCs后均有PLC-γ、p-ERK的表

29、達。bFGF作用組和PDGF-BB作用組：PLC-γ、p-ERK表達與對照組比均有顯著差異，且在一定范圍內(nèi)隨時間增加而逐漸增多。
　　 10、bFGF和PDGF-BB作用EPCs后VEGF的表達ELISA檢測結果顯示：EPCs在bFGF作用下可以產(chǎn)生VEGF，且在一定范圍內(nèi)隨時間的增加而增多，在PDGF-BB組VEGF也在一定范圍內(nèi)出現(xiàn)時間依賴性增加，但是較bFGF誘導組增加的少。
　　 結論:
　　 1、bFG

30、F可以誘導大鼠EPCs向內(nèi)皮方向分化。
　　 2、PDGF-BB可以誘導大鼠EPCs向平滑肌方向分化。
　　 3、內(nèi)皮樣細胞和平滑肌樣細胞可以增殖、遷移和形成共同的血管網(wǎng)。
　　 4、bFGF可以促進大鼠EPCs的PDGFRβmRNA轉(zhuǎn)錄。
　　 5、bFGF和PDGF-BB可能通過啟動大鼠EPCs中PLC-r和p-ERK途徑而發(fā)揮作用。
　　 6、bFGF促進大鼠EPCs分化為成熟內(nèi)皮的作用可能