PDGF-BB誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬與血管鈣化的關(guān)系及其作用機(jī)制.pdf

1、目的：研究表明，自噬可能是一種新的自我適應(yīng)機(jī)制，通過(guò)減少釋放基質(zhì)小泡，自噬可以降低磷酸鹽引起的血管鈣化。此外，阿伐他汀通過(guò)抑制β-catenin信號(hào)通路引起自噬，從而降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）引起的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）鈣化。血小板源生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor， PD

2、GF-BB）能夠誘導(dǎo)自噬發(fā)生，降解收縮蛋白，調(diào)控VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承停黾恿搜趸瘧?yīng)激時(shí)細(xì)胞的生存能力。然而，PDGF-BB誘導(dǎo)的 VSMC自噬與血管鈣化的關(guān)系尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)利用 PDGF-BB刺激VSMCs不同時(shí)間，探討VSMC自噬與血管鈣化的相關(guān)性及其作用機(jī)制。
　　方法：⑴選取80-100g雄性SD大鼠（清潔級(jí)），貼塊法分離胸腹主動(dòng)脈培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%匯合后，0.2

3、5%胰蛋白酶消化傳代，取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。⑵取等量的蛋白進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），半干法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。以5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h。加入一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜后以HPR標(biāo)記的IgG二抗37℃封閉2 h，TBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光成像。⑶處理后的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，1%Triton X-100處理15 min，10%山羊血清室溫封閉30 min后，分別加入兔抗Bec

4、lin1多克隆抗體與兔抗LC3多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)PBS充分漂洗后，加入Alexa Fluor555標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗室溫孵育，激光共聚焦顯微鏡下觀察。⑷處理后的細(xì)胞溶解于緩沖液（50 mM Tris-HCl, pH7.6,150 mM NaCl,1%NP-40,10 mM磷酸二氫鈉,10 mM NaF,2 mM PMSF）中，4℃離心后，吸取上清，分別加入 Beclin1抗體或 PI3KC3抗體，然后加入 Protein A

5、–agarose4℃過(guò)夜，洗滌后，收集Protein A-抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行Western blot檢測(cè)。
　　結(jié)果：①PDGF-BB（10 ng/mL）刺激VSMCs不同時(shí)間（6、12、24、48、72 h），同時(shí)設(shè)不含刺激物的陰性對(duì)照組。Western blot分析檢測(cè)血管鈣化相關(guān)蛋白BMP2與ALP的表達(dá)。結(jié)果顯示，BMP2與ALP的表達(dá)隨刺激時(shí)間不同而變化，呈先降低后增高的趨勢(shì)，ALP在12 h達(dá)到低谷，BMP2在6 h

6、達(dá)到低谷。②PDGF-BB刺激VSMCs不同時(shí)間（6、12、24、48、72 h），Western blot分析檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3的表達(dá)，其中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化率增加表明自噬活動(dòng)增強(qiáng)，它被認(rèn)為是一個(gè)可靠的自噬體形成標(biāo)志。結(jié)果顯示，Beclin1的表達(dá)隨刺激時(shí)間不同而變化，呈先增高后降低的趨勢(shì)，且在12 h達(dá)到高峰。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)，并在48 h時(shí)達(dá)到高峰，隨后降低。細(xì)胞免疫熒光染色

7、結(jié)果亦顯示，與對(duì)照組相比， PDGF-BB刺激12 h后，LC3與Beclin1的表達(dá)均顯著增強(qiáng)。③3-MA（10mM）預(yù)孵育VSMCs2h后，PDGF-BB刺激12 h，Western blot分析檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3的表達(dá)，結(jié)果顯示，3-MA明顯降低PDGF-BB誘導(dǎo)的Beclin1與LC3的表達(dá)。免疫熒光染色也顯示類似結(jié)果，與PDGF-BB刺激組相比，3-MA/PDGF-BB刺激組的細(xì)胞中Beclin1與 LC3

8、的表達(dá)明顯減弱。隨后，觀察3-MA對(duì)血管鈣化相關(guān)蛋白BMP2與ALP表達(dá)的影響。Western blot結(jié)果顯示，與PDGF-BB刺激組相比，3-MA預(yù)孵育的PDGF-BB刺激組中BMP2與ALP的表達(dá)明顯增高。④PDGF-BB刺激VSMCs不同時(shí)間（0、6、12、24 h），細(xì)胞裂解液分別用Beclin1抗體與PI3KC3抗體進(jìn)行交互免疫共沉淀分析，結(jié)果顯示，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，Beclin1與PI3KC3的相互作用逐漸增強(qiáng)，12 h

9、達(dá)到高峰，24 h仍維持較高水平。然后，細(xì)胞裂解液用抗p-Ser抗體進(jìn)行免疫沉淀后，用抗Beclin1抗體檢測(cè)磷酸化的 Beclin1水平，結(jié)果顯示， PDGF-BB處理VSMCs后，Beclin1磷酸化水平增高，6h達(dá)到高峰，12h仍維持較高水平。
　　結(jié)論：⑴PDGF-BB刺激早期抑制VSMC鈣化，晚期促進(jìn)VSMC鈣化。⑵PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC自噬被3-MA抑制后，VSMC鈣化加劇。⑶PDGF-BB通過(guò)誘導(dǎo)Beclin1