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文檔簡介
1、受限于人體組織有限的再生修復能力,骨缺損的修復重建一直是骨科的一大難題。近年來,組織工程技術的逐漸興起為克服這一難題提供了有效的解決策略,然而組織工程骨的血管化問題成為限制其發(fā)揮生物學效能的一個“瓶頸”。
血管內皮祖細胞(Endothelialprogenitorcells,EPCs)具有在體外形成內皮樣克隆與促進體內血管生成(Angiogenesis)的能力,有可能被用于解決血管化這一“瓶頸”問題。骨是一種高度血管化的組織,
2、而血管生成是骨再生修復過程中一個至關重要的基本環(huán)節(jié)。國內外許多研究證實:EPCs可以通過增強骨修復過程中的血管生成與骨形成能力來促進骨缺損修復。然而,目前絕大多數(shù)的研究都只聚焦于EPCs對骨形成(boneformation)的促進效果,而基于EPC的血管生成對骨缺損修復的促進機制卻未被進一步闡明。
骨缺損修復重建是由多種細胞、因子以及細胞外基質共同參與的一個復雜、連續(xù)的生物學過程。而在這一過程中,行使骨吸收功能的破骨細胞與行使
3、骨形成功能的成骨細胞發(fā)揮著重要作用。在骨缺損修復重建的早期,破骨細胞吸收陳舊或壞死的骨組織,為成骨細胞及其前體細胞的進入與新骨的形成創(chuàng)造空間。而在骨缺損修復重建的晚期,骨組織開始持續(xù)的重建塑形,這一過程也是通過破骨細胞的骨吸收活動以及成骨細胞的骨形成活動來實現(xiàn)的。EPCs是內皮細胞的前體細胞,可以看作是代表血管生成活動的細胞模型;破骨與成骨前體細胞作為破骨與成骨細胞的前體細胞,分別代表著破骨與成骨活動。探索這三種前體細胞之間的相互作用,
4、將有助于進一步理解EPCs在骨缺損修復重建中的作用及其機制。
為探討EPCs在骨缺損修復重建中的作用及其機制,本研究首先通過分離、培養(yǎng)、鑒定小鼠骨髓源的EPCs,并建立小鼠EPCs與RAW264.7單核細胞(作為破骨前體細胞)非接觸式共培養(yǎng)體系以研究EPCs對破骨前體細胞體外生物學行為的影響;接下來,我們從兔骨髓中分離培養(yǎng)EPCs與間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并進行細胞鑒定,然后進一步
5、研究EPCs共培養(yǎng)對MSCs存活、分化等體外生物學行為的影響。隨后通過將EPCs與MSCs共接種于脫鈣骨基質(Demineralized bone matrix,DBM)上作為預血管化組織工程骨,并將預血管化組織工程骨植入兔橈骨骨缺損處,用以研究EPCs預血管化組織工程骨在促進骨缺損修復重建過程中是否有助于新生骨組織結構的重建與功能的恢復。
方法及結果:
1.采用Percoll密度梯度離心法從C57/BL6小鼠骨髓中
6、分離單個核細胞,經誘導培養(yǎng)獲取EPCs并體外擴增,然后通過流式細胞檢測、免疫雙熒光標記以及免疫組織化學等手段對EPCs進行鑒定。利用Transwell小室(孔徑3.0um)將小鼠EPCs與破骨前體細胞RAW264.7細胞株進行非接觸式共培養(yǎng),并通過CCK-8(CellCountingKit-8)試劑盒檢測EPCs對RAW264.7細胞存活的影響。利用孔徑為8.0um的Transwell小室進行Transwell遷移實驗,觀察EPCs對R
7、AW264.7細胞的遷移能力的影響。為了觀察EPCs對RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響,將共培養(yǎng)組與陰性對照組(RAW264.7細胞,無其他的處理)以及陽性對照組(RANKL+M-SCF誘導培養(yǎng))進行對比。通過比較共培養(yǎng)組、陰性對照組以及陽性對照組中類破骨細胞(TRAP染色陽性,細胞核≥3)的數(shù)目,結果顯示EPCs共培養(yǎng)組中的類破骨細胞數(shù)顯著高于陰性對照組,但仍低于陽性對照組,提示EPCs能促進破骨前體細胞向破骨分化。這些結果表
8、明,EPCs可以促進破骨前體細胞存活、遷移與分化等生物學行為。進一步分析,EPCs可通過分泌VEGF-A、SDF-1α以及TGF-β1等多種細胞因子,并通過影響Akt、ERK1/2、P38MARK、Smad等多條信號通路參與調控RAW264.7細胞的生物學行為。
2.采用Percoll密度梯度離心法分離兔骨髓中的單個核細胞并進行體外誘導培養(yǎng),分別獲得兔骨髓源的EPCs和MSCs。將兩種細胞分別進行培養(yǎng)與鑒定,并將EPCs和MS
9、Cs按2:1,1:1,1:2三種不同比例進行細胞接種共培養(yǎng),確定MSCs與EPCs的最佳細胞共接種比例為1:1。隨后按1:1的比例將MSCs與EPCs進行共培養(yǎng),研究EPCs對MSCs存活與分化等生物學行為的影響,發(fā)現(xiàn)EPCs可以提高MSCs的體外存活能力,并促進MSCs向成骨方向分化。此外,按1:1的比例將MSCs與EPCs共接種于DBM支架材料上以構建預血管化組織工程骨,評價EPCs/MSCs共接種對組織工程骨細胞上架率的影響,結果
10、顯示EPCs/MSCs共接種組的細胞上架率顯著高于MSCs單一接種組,提示共接種可以使組織工程骨獲得更高的細胞上架率。
3.于兔雙側橈骨中段各截取一15mm的骨段以制備兔橈骨骨缺損模型。24只新西蘭大白兔,共計48處骨缺損,隨機分為三組:預血管化組植入EPCs/MSCs共接種的預血管化組織工程骨,普通TEB植入MSCs單一接種的組織工程骨,對照組植入無任何的細胞的DBM支架材料。通過影像學、組織形態(tài)學等方法觀察骨缺損區(qū)的血管與
11、骨修復重建的變化,探討EPCs預血管化組織工程骨對骨缺損修復重建的促進作用。免疫組織組化學結果顯示,EPCs預血管化組織工程骨內血管化相關因子(VEGF與VIII因子)的表達在術后早期顯著高于其它組的組織工程骨;而骨核素檢測進一步證實,術后2-12周預血管化組骨缺損區(qū)的血供均顯著高于其它實驗組,提示EPCs能更早地實現(xiàn)骨內血管循環(huán)系統(tǒng)的重建。影像學結果發(fā)現(xiàn),除術后第2周時預血管化組與普通TEB組的評分無顯著差異,術后第4-12周預血管化
12、組的影像學評分均顯著高于其它各組;術后第12周的墨汁灌注形態(tài)學觀察以及顯微計算機斷層掃描(Micro-CT)檢測結果顯示,預血管化組骨缺損區(qū)新生骨組織的髓腔與髓內血管已基本再通,普通TEB組僅部分再通,而對照組髓腔仍處于封閉狀態(tài),這表明EPCs預血管化組織工程骨不僅能促進早期骨痂的形成,實現(xiàn)骨缺損區(qū)的橋接(bridging),還可以加速新生骨組織的重建塑形,促進髓腔與髓內血管更早地實現(xiàn)再通。骨密度檢測與生物力學測試結果顯示EPCs組的骨
13、密度與力學強度均顯著高于其它各組,提示EPCs預血管化組織工程骨除了可以促進早期血管化與缺損區(qū)組織修復,還可以促進骨力學性能的恢復,實現(xiàn)骨結構與功能的共同恢復,從而最終實現(xiàn)骨缺損的完全修復重建。
結論:
1.EPCs可通過分泌VEGF-A、SDF-1α以及TGF-β1等多種細胞因子,并經過Akt、ERK1/2、P38MARK、Smad等多條信號通路促進RAW264.7細胞存活、遷移以及分化等生物學行為。
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