血管內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)骨缺損修復(fù)重建的作用機(jī)制研究.pdf

1、受限于人體組織有限的再生修復(fù)能力,骨缺損的修復(fù)重建一直是骨科的一大難題。近年來(lái),組織工程技術(shù)的逐漸興起為克服這一難題提供了有效的解決策略,然而組織工程骨的血管化問(wèn)題成為限制其發(fā)揮生物學(xué)效能的一個(gè)“瓶頸”。
　　血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelialprogenitorcells,EPCs)具有在體外形成內(nèi)皮樣克隆與促進(jìn)體內(nèi)血管生成(Angiogenesis)的能力,有可能被用于解決血管化這一“瓶頸”問(wèn)題。骨是一種高度血管化的組織,

2、而血管生成是骨再生修復(fù)過(guò)程中一個(gè)至關(guān)重要的基本環(huán)節(jié)。國(guó)內(nèi)外許多研究證實(shí):EPCs可以通過(guò)增強(qiáng)骨修復(fù)過(guò)程中的血管生成與骨形成能力來(lái)促進(jìn)骨缺損修復(fù)。然而,目前絕大多數(shù)的研究都只聚焦于EPCs對(duì)骨形成(boneformation)的促進(jìn)效果,而基于EPC的血管生成對(duì)骨缺損修復(fù)的促進(jìn)機(jī)制卻未被進(jìn)一步闡明。
　　骨缺損修復(fù)重建是由多種細(xì)胞、因子以及細(xì)胞外基質(zhì)共同參與的一個(gè)復(fù)雜、連續(xù)的生物學(xué)過(guò)程。而在這一過(guò)程中,行使骨吸收功能的破骨細(xì)胞與行使

3、骨形成功能的成骨細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。在骨缺損修復(fù)重建的早期,破骨細(xì)胞吸收陳舊或壞死的骨組織,為成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞的進(jìn)入與新骨的形成創(chuàng)造空間。而在骨缺損修復(fù)重建的晚期,骨組織開始持續(xù)的重建塑形,這一過(guò)程也是通過(guò)破骨細(xì)胞的骨吸收活動(dòng)以及成骨細(xì)胞的骨形成活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,可以看作是代表血管生成活動(dòng)的細(xì)胞模型;破骨與成骨前體細(xì)胞作為破骨與成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞,分別代表著破骨與成骨活動(dòng)。探索這三種前體細(xì)胞之間的相互作用,

4、將有助于進(jìn)一步理解EPCs在骨缺損修復(fù)重建中的作用及其機(jī)制。
　　為探討EPCs在骨缺損修復(fù)重建中的作用及其機(jī)制,本研究首先通過(guò)分離、培養(yǎng)、鑒定小鼠骨髓源的EPCs,并建立小鼠EPCs與RAW264.7單核細(xì)胞(作為破骨前體細(xì)胞)非接觸式共培養(yǎng)體系以研究EPCs對(duì)破骨前體細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響;接下來(lái),我們從兔骨髓中分離培養(yǎng)EPCs與間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)并進(jìn)行細(xì)胞鑒定,然后進(jìn)一步

5、研究EPCs共培養(yǎng)對(duì)MSCs存活、分化等體外生物學(xué)行為的影響。隨后通過(guò)將EPCs與MSCs共接種于脫鈣骨基質(zhì)(Demineralized bone matrix,DBM)上作為預(yù)血管化組織工程骨,并將預(yù)血管化組織工程骨植入兔橈骨骨缺損處,用以研究EPCs預(yù)血管化組織工程骨在促進(jìn)骨缺損修復(fù)重建過(guò)程中是否有助于新生骨組織結(jié)構(gòu)的重建與功能的恢復(fù)。
　　方法及結(jié)果:
　　1.采用Percoll密度梯度離心法從C57/BL6小鼠骨髓中

6、分離單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取EPCs并體外擴(kuò)增,然后通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)、免疫雙熒光標(biāo)記以及免疫組織化學(xué)等手段對(duì)EPCs進(jìn)行鑒定。利用Transwell小室(孔徑3.0um)將小鼠EPCs與破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng),并通過(guò)CCK-8(CellCountingKit-8)試劑盒檢測(cè)EPCs對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活的影響。利用孔徑為8.0um的Transwell小室進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn),觀察EPCs對(duì)R

7、AW264.7細(xì)胞的遷移能力的影響。為了觀察EPCs對(duì)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響,將共培養(yǎng)組與陰性對(duì)照組(RAW264.7細(xì)胞,無(wú)其他的處理)以及陽(yáng)性對(duì)照組(RANKL+M-SCF誘導(dǎo)培養(yǎng))進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)比較共培養(yǎng)組、陰性對(duì)照組以及陽(yáng)性對(duì)照組中類破骨細(xì)胞(TRAP染色陽(yáng)性,細(xì)胞核≥3)的數(shù)目,結(jié)果顯示EPCs共培養(yǎng)組中的類破骨細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對(duì)照組,但仍低于陽(yáng)性對(duì)照組,提示EPCs能促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨分化。這些結(jié)果表

8、明,EPCs可以促進(jìn)破骨前體細(xì)胞存活、遷移與分化等生物學(xué)行為。進(jìn)一步分析,EPCs可通過(guò)分泌VEGF-A、SDF-1α以及TGF-β1等多種細(xì)胞因子,并通過(guò)影響Akt、ERK1/2、P38MARK、Smad等多條信號(hào)通路參與調(diào)控RAW264.7細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　2.采用Percoll密度梯度離心法分離兔骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng),分別獲得兔骨髓源的EPCs和MSCs。將兩種細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)與鑒定,并將EPCs和MS

9、Cs按2:1,1:1,1:2三種不同比例進(jìn)行細(xì)胞接種共培養(yǎng),確定MSCs與EPCs的最佳細(xì)胞共接種比例為1:1。隨后按1:1的比例將MSCs與EPCs進(jìn)行共培養(yǎng),研究EPCs對(duì)MSCs存活與分化等生物學(xué)行為的影響,發(fā)現(xiàn)EPCs可以提高M(jìn)SCs的體外存活能力,并促進(jìn)MSCs向成骨方向分化。此外,按1:1的比例將MSCs與EPCs共接種于DBM支架材料上以構(gòu)建預(yù)血管化組織工程骨,評(píng)價(jià)EPCs/MSCs共接種對(duì)組織工程骨細(xì)胞上架率的影響,結(jié)果

10、顯示EPCs/MSCs共接種組的細(xì)胞上架率顯著高于MSCs單一接種組,提示共接種可以使組織工程骨獲得更高的細(xì)胞上架率。
　　3.于兔雙側(cè)橈骨中段各截取一15mm的骨段以制備兔橈骨骨缺損模型。24只新西蘭大白兔,共計(jì)48處骨缺損,隨機(jī)分為三組:預(yù)血管化組植入EPCs/MSCs共接種的預(yù)血管化組織工程骨,普通TEB植入MSCs單一接種的組織工程骨,對(duì)照組植入無(wú)任何的細(xì)胞的DBM支架材料。通過(guò)影像學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等方法觀察骨缺損區(qū)的血管與

11、骨修復(fù)重建的變化,探討EPCs預(yù)血管化組織工程骨對(duì)骨缺損修復(fù)重建的促進(jìn)作用。免疫組織組化學(xué)結(jié)果顯示,EPCs預(yù)血管化組織工程骨內(nèi)血管化相關(guān)因子(VEGF與VIII因子)的表達(dá)在術(shù)后早期顯著高于其它組的組織工程骨;而骨核素檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí),術(shù)后2-12周預(yù)血管化組骨缺損區(qū)的血供均顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組,提示EPCs能更早地實(shí)現(xiàn)骨內(nèi)血管循環(huán)系統(tǒng)的重建。影像學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),除術(shù)后第2周時(shí)預(yù)血管化組與普通TEB組的評(píng)分無(wú)顯著差異,術(shù)后第4-12周預(yù)血管化

12、組的影像學(xué)評(píng)分均顯著高于其它各組;術(shù)后第12周的墨汁灌注形態(tài)學(xué)觀察以及顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)檢測(cè)結(jié)果顯示,預(yù)血管化組骨缺損區(qū)新生骨組織的髓腔與髓內(nèi)血管已基本再通,普通TEB組僅部分再通,而對(duì)照組髓腔仍處于封閉狀態(tài),這表明EPCs預(yù)血管化組織工程骨不僅能促進(jìn)早期骨痂的形成,實(shí)現(xiàn)骨缺損區(qū)的橋接(bridging),還可以加速新生骨組織的重建塑形,促進(jìn)髓腔與髓內(nèi)血管更早地實(shí)現(xiàn)再通。骨密度檢測(cè)與生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示EPCs組的骨

13、密度與力學(xué)強(qiáng)度均顯著高于其它各組,提示EPCs預(yù)血管化組織工程骨除了可以促進(jìn)早期血管化與缺損區(qū)組織修復(fù),還可以促進(jìn)骨力學(xué)性能的恢復(fù),實(shí)現(xiàn)骨結(jié)構(gòu)與功能的共同恢復(fù),從而最終實(shí)現(xiàn)骨缺損的完全修復(fù)重建。
　　結(jié)論:
　　1.EPCs可通過(guò)分泌VEGF-A、SDF-1α以及TGF-β1等多種細(xì)胞因子,并經(jīng)過(guò)Akt、ERK1/2、P38MARK、Smad等多條信號(hào)通路促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞存活、遷移以及分化等生物學(xué)行為。
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