影響丁香假單胞菌冰核收拾InaQ分泌活性效應(yīng)基因的研究.pdf

1、丁香假單胞菌是一種常見植物致病菌，可以引發(fā)多種植物產(chǎn)生超敏反應(yīng)，而且該菌還是一種冰核細(xì)菌，可使植物在較高溫度下產(chǎn)生凍害。誘發(fā)植物凍害的關(guān)鍵因素為其分泌的一種蛋白，冰核蛋白(Icenucleationprotein，INP)。本課題以一株具有高冰核活性的丁香假單胞菌MB03為研究對象，構(gòu)建了一個轉(zhuǎn)座突變文庫，對影響丁香假單胞菌冰核蛋白分泌的相關(guān)活性效應(yīng)基因的進(jìn)行了研究。
　　丁香假單胞菌MB03是本實(shí)驗室所分離保存的一株具有高冰核活

2、性的丁香假單胞菌，其INP基因inaQ已完成克隆測序。本實(shí)驗利用“自殺性”轉(zhuǎn)座子pUT-miniTn5-Km2，采用雙親本接合的方法構(gòu)建了丁香假單胞菌MB03的突變文庫。根據(jù)inaQ基因序列設(shè)計引物擴(kuò)增得到其N端，連接pET-28a表達(dá)載體，獲得INPN蛋白并制備其抗血清，然后利用免疫學(xué)方法對INP分泌進(jìn)行分析。先用膜雜交的方法對突變文庫中菌株進(jìn)行初步篩選，從中篩選出INP分泌發(fā)生明顯變化的菌株，再對這些菌株進(jìn)行Cy5流式細(xì)胞儀檢測驗證

3、，從而得到INP分泌明顯增強(qiáng)和明顯減弱的菌株。
　　對突變菌株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定采用改進(jìn)的TAIL-PCR方法，通過已知序列上3個嵌套的特異性引物分別和簡并引物組合進(jìn)行連續(xù)的PCR循環(huán)，選擇性地擴(kuò)增得到目標(biāo)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序。通過TAIL-PCR，從幾株InaQ分泌活性增強(qiáng)或減弱突變株中擴(kuò)增到疑似插入位點(diǎn)側(cè)翼基因。經(jīng)對其測序和將測序結(jié)果與MB03基因組序列進(jìn)行對比，最終鑒定出mini-Tn5插入失活的基因檸檬酸合成酶基因(g