丁香假單胞菌極毛蛋白HrpA的克隆表達(dá)與單鏈抗體的制備.pdf

1、大多數(shù)的植物病原菌如Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas和Ralstonia都含有hrp基因(haypersensitive response and pathogenicity genes)。這些病原菌的hrp基因不僅控制著在宿主植物上引起致病性，而且控制著在非宿主植物上引起超敏反應(yīng)(hypersensitive response)。病原菌在侵入植物細(xì)胞時(shí)，hrp基因簇中的結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)，會(huì)在病原菌表面

2、形成一種絲狀的類(lèi)似鞭毛的附屬物，稱為Hrp極毛(Hrp pilus)。病原菌能否使親和性的植物發(fā)病與其有無(wú)Hrp極毛有直接的關(guān)系，Hrp極毛在植物與病原菌的相互作用中扮演十分重要的角色。
　　 我們通過(guò)NCBI找到P．syringae pv tomato DC3000的Hrp)極毛蛋白HrpA的序列，將其克隆到pET32a(+)載體上，制備人工表達(dá)的HrpA蛋白抗原，在后續(xù)試驗(yàn)中，我們需要測(cè)定免疫小鼠的血清效價(jià)，為排除融合蛋白硫

3、氧還蛋白(Trx)的干擾，我們又把它克隆到pET28a(+)載體上，并表達(dá)純化目的蛋白用于檢測(cè)。
　　 以純化的目的蛋白(由載體pET32a(+)—HrpA表達(dá))免疫Balb/c雌性小鼠，達(dá)到一定效價(jià)后，提取脾臟總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，擴(kuò)增得到VL和VH，通過(guò)組裝得到scFv基因。然后將其構(gòu)建到噬菌體載體pCANTAB—5E上，建立噬菌體單鏈抗體初級(jí)文庫(kù)。通過(guò)富集淘選過(guò)程后，最終選出親和力最高的單鏈抗體，命名為SF1，最后