丁香假單胞菌極毛蛋白HrpA的克隆表達與單鏈抗體的制備.pdf

1、大多數(shù)的植物病原菌如Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas和Ralstonia都含有hrp基因(haypersensitive response and pathogenicity genes)。這些病原菌的hrp基因不僅控制著在宿主植物上引起致病性，而且控制著在非宿主植物上引起超敏反應(hypersensitive response)。病原菌在侵入植物細胞時，hrp基因簇中的結構基因編碼的蛋白質，會在病原菌表面

2、形成一種絲狀的類似鞭毛的附屬物，稱為Hrp極毛(Hrp pilus)。病原菌能否使親和性的植物發(fā)病與其有無Hrp極毛有直接的關系，Hrp極毛在植物與病原菌的相互作用中扮演十分重要的角色。
　　 我們通過NCBI找到P．syringae pv tomato DC3000的Hrp)極毛蛋白HrpA的序列，將其克隆到pET32a(+)載體上，制備人工表達的HrpA蛋白抗原，在后續(xù)試驗中，我們需要測定免疫小鼠的血清效價，為排除融合蛋白硫

3、氧還蛋白(Trx)的干擾，我們又把它克隆到pET28a(+)載體上，并表達純化目的蛋白用于檢測。
　　 以純化的目的蛋白(由載體pET32a(+)—HrpA表達)免疫Balb/c雌性小鼠，達到一定效價后，提取脾臟總RNA經(jīng)反轉錄得到cDNA，擴增得到VL和VH，通過組裝得到scFv基因。然后將其構建到噬菌體載體pCANTAB—5E上，建立噬菌體單鏈抗體初級文庫。通過富集淘選過程后，最終選出親和力最高的單鏈抗體，命名為SF1，最后