檉柳鋅指蛋白基因ThZFP3的功能研究.pdf

1、ZFP(Zinc Finger Proteins)轉(zhuǎn)錄因子是植物中的一大類(lèi)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，主要在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆境脅迫等方面具有重要的作用。本研究從檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出一條鹽脅迫響應(yīng)的鋅指蛋白基因，命名為T(mén)hZFP3，該基因全長(zhǎng)1335bp，編碼444氨基酸，屬于CCCH型鋅指蛋白基因家族，編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量48491.6Da，理論等電點(diǎn)(PI)為8.08。構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-GFP-ThZFP3，利用基因槍技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

2、洋蔥表皮研究亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明ThZFP3蛋白定位在細(xì)胞核中。
　　利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定ThZFP3轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，確定其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)位于C端的225～280氨基酸區(qū)段。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)分析顯示，該基因受高鹽、干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，暗示ThZFP3可能在檉柳抗旱耐鹽過(guò)程中發(fā)揮重要作用。構(gòu)建ThZFP3基因的過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得T3代轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因株系擬南芥進(jìn)行NaCl和Mannito

3、l脅迫處理，脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率、根長(zhǎng)、鮮重及長(zhǎng)勢(shì)都優(yōu)于野生型株系，表明ThZFP3基因能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性和耐旱性。
　　構(gòu)建RNAi載體pFGC5941-ThZFP3，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)將農(nóng)桿菌pROKⅡ-ThZFP3、pFGC5941-ThZFP3和pROKⅡ轉(zhuǎn)入檉柳，獲得過(guò)表達(dá)(OE)、抑制表達(dá)(RNAi)和對(duì)照（Control）轉(zhuǎn)基因植株，分析三種轉(zhuǎn)基因植株在NaCl和Mannitol脅迫下的抗逆能力。DAB

4、、NBT和Evans blue組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)植株(OE)細(xì)胞內(nèi)的O2-和H2O2含量明顯低于比Control和RNAi植株，說(shuō)明過(guò)表達(dá)株系受脅迫后細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較為完整，受損傷程度低，而抑制表達(dá)株系細(xì)胞受損傷程度最嚴(yán)重。測(cè)定三種轉(zhuǎn)基因植株的失水率、葉綠素含量、PRO含量、H2O2含量、MDA含量、POD和SOD活性等生理指標(biāo)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)植株(OE)的失水率、ROS含量和MDA含量相對(duì)最低，葉綠素含量、PRO含量、POD活性