人Brg1蛋白Bromodomain結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)測(cè)定及其與乙酰化組蛋白的相互作用研究.pdf

1、本論文工作的重點(diǎn)是人染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF的核心亞基Brg1的Bromodomain結(jié)構(gòu)域的克隆、表達(dá)、純化和溶液結(jié)構(gòu)測(cè)定以及它與乙?；M蛋白尾巴的相互作用研究。論文分為以下兩個(gè)部分： 第一部分對(duì)染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物(第一章)、組蛋白密碼(第二章)和Brg1蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能(第三章)進(jìn)行全面的綜述。染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物是真核生物基因轉(zhuǎn)錄的共調(diào)控因子，它通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而使相應(yīng)的基因“裸露”出來(lái)，使其它轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物

2、能夠在正確的位置裝配，從而激活基因表達(dá)。真核生物的染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物至少可分為4類：SWI/SNF。類，ISWI類，Mi-2類和DOMINO類，它們對(duì)染色質(zhì)的重構(gòu)都依賴于ATP的水解。染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物還在DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)和基因的轉(zhuǎn)錄抑制中起作用。 組蛋白密碼是指一條或幾條組蛋白尾巴的順序修飾(乙?；?、甲基化、磷酸化、SUMO化、泛素化等)及其組合。這些密碼可以被含有特定結(jié)構(gòu)域如Bromodomain和chromodoma

3、in的蛋白質(zhì)解讀。這些蛋白質(zhì)又招募其效應(yīng)蛋白質(zhì)，如通用轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶等，從而啟動(dòng)下游生物學(xué)反應(yīng)如染色質(zhì)凝集、DNA修復(fù)或轉(zhuǎn)錄激活/抑制。不同的修飾方式及其組合產(chǎn)生不同的局部結(jié)構(gòu)和不同的生物學(xué)功能。組蛋白密碼是表觀遺傳的重要內(nèi)容之一。 作為SWI/SNF復(fù)合物的核心組分，Brg1在基因調(diào)控，細(xì)胞因子應(yīng)答，腫瘤發(fā)生，發(fā)育和分化過(guò)程中起重要作用。5-6％的酵母基因受Brg1調(diào)控，哺乳動(dòng)物中至少有100多個(gè)基因受其影響。最顯著的

4、是Brg1可促進(jìn)CDK抑制蛋白p21和p15的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)與pRB的相互作用抑制E2F目標(biāo)蛋白質(zhì)(包括cyclin E，cyclin A和CDC2)的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期中止。因此，Brg1功能的喪失可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。10％的肺癌同時(shí)伴有BRG1的缺失。乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌細(xì)胞系中也有較高比例的BRG1基因突變。Brg1還在發(fā)育和分化中起重要作用。許多發(fā)育分化相關(guān)的調(diào)控因子都通過(guò)SWUSNF發(fā)揮其作用。紅細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脂肪細(xì)胞

5、、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控基因的激活都需要SWI/SNF的參與。如生肌決定因子(MyoD)的轉(zhuǎn)錄激活作用需要Brg1的參與：神經(jīng)元分化因子NeuroD和Ngnr1的促神經(jīng)生成作用依賴于Brg1。 第二部分詳細(xì)介紹了Brg1 Bromodomain的溶液結(jié)構(gòu)及其與乙酰化組蛋白的相互作用研究。Bromodomain主要存在于染色質(zhì)調(diào)控蛋白質(zhì)中，專一性結(jié)合乙?；嚢彼?，在組蛋白密碼的解讀中起重要作用。它有約110個(gè)氨基酸

6、殘基，是左手四螺旋束的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。 我們通過(guò)基因重組表達(dá)了<'15>N-標(biāo)記和<'15>N/<'13>C雙標(biāo)記的Brg1 Bromodomain蛋白質(zhì)。用Ni離子親和層析和分子篩兩步純化獲得了較穩(wěn)定的NMR實(shí)驗(yàn)樣品。通過(guò)異核三維核磁共振的方法，測(cè)定了Brg1 Bromodomain的溶液結(jié)構(gòu)。解析出的Brg1Bromodomain溶液結(jié)構(gòu)同其它Bromodomain蛋白質(zhì)相似，都具有Bromodomain特征的左手四螺旋結(jié)構(gòu)，在螺

7、旋束的一端有一個(gè)疏水的乙?；嚢彼峤Y(jié)合口袋；不同的是Brgl Bromodomain的第一個(gè)螺旋αZ比其它Bromodomain短約4個(gè)氨基酸。用CE方法，我們發(fā)現(xiàn)在已知結(jié)構(gòu)中，它與scGCN5的結(jié)構(gòu)相似性最高(RMSD≈2．1A)。 用化學(xué)位移干擾實(shí)驗(yàn)，我們研究了Brg1 Bromodomain對(duì)不同位點(diǎn)乙?；慕M蛋白N-端多肽結(jié)合專一性并計(jì)算了解離常數(shù)(K<,D>)。NMR滴定結(jié)果顯示乙?；慕M蛋白多肽對(duì)Brg1 Bromo

8、domain的化學(xué)位移都有不同程度的干擾，但所需的多肽濃度都較高。這表明Brg1 Bromodomain對(duì)乙?；M蛋白有比較弱的相互作用。其中，H3-AcK14的親和力最大(K<,D>≈1．2mM)，H4-AcK8(K<,D>≈4．0mM)和H4-AcK12(K<,D>≈3．6mM)次之，H4-AeK16和H2B AcK5最弱。非乙酰化的H4 N-端多肽不能結(jié)合Brg1 Bromodomain。 以seGcn5與組蛋白H3-Ac

9、Kl6多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1E6I．pdb)為模板，用分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)的方法，我們構(gòu)建了Brg1 Bromodomain與組蛋白N-端多肽H3-AcK14的復(fù)合物模型。分析發(fā)現(xiàn)殘基F1485、L1488、L1494、F1539、N1540與H3-AcK14有相互作用；T1538與H3-AcK14的Arg 17之間存在氫鍵。 為驗(yàn)證化學(xué)位移干擾實(shí)驗(yàn)和復(fù)合物模型所揭示的相互作用，我們進(jìn)行了Brg1 Bromod