人脂肪間充質(zhì)干細胞的分離鑒定及向肝臟樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：探討人脂肪間充質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定及向肝臟樣細胞分化的方法。
　　方法：將脂肪組織切成小于1mm3的碎片,用膠原酶Ⅰ消化離心法獲得人脂肪間充質(zhì)干細胞,然后以1×104/cm2的細胞濃度,接種于含體積分數(shù)為10％胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng);觀察原代細胞形態(tài)及生長情況;取第5代細胞接種于24孔板中,每天消化3個孔,計算細胞數(shù)量,取其平均數(shù)繪制細胞生長曲線;取第5代細胞,胰酶消化后,用流式細

2、胞儀檢測干細胞相關(guān)表面抗原CD13、CD73、CD34、CD45和HLA-DR;取第5代細胞接種于6孔板中,實驗組分別用誘導培養(yǎng)基向成脂及成骨方向誘導,對照組用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),檢測其多向分化潛能;取第5代細胞,接種于培養(yǎng)瓶及24孔板中,實驗組用含有ActivinA、HGF、FGF、EGF、OSM、DMSO等細胞因子的兩階段法肝臟樣細胞誘導培養(yǎng)基培養(yǎng),對照組用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并觀察細胞形

3、態(tài)變化及生長情況,于誘導至第13天時,采用RT-PCR法檢測肝細胞相關(guān)基因表達,采用PAS染色法檢測肝臟樣細胞糖原合成情況,采用細胞免疫組化法檢測肝細胞相關(guān)抗原的表達。
　　結(jié)果：用消化離心法分離獲取的脂肪間充質(zhì)干細胞大小均勻,呈梭形的成纖維細胞樣,細胞增殖良好;細胞生長曲線測定表明接種后第3天細胞進入指數(shù)增長期,第6天后生長進入平臺期,體外能長期培養(yǎng)存活,并保持不分化狀態(tài);流式細胞儀檢測表明細胞高表達CD13、CD73,低表達C

4、D34、CD45及HLA-DR;并能被誘導成脂肪細胞及成骨細胞;上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了人原代脂肪干細胞系。人脂肪干細胞經(jīng)成肝誘導后,細胞形態(tài)由梭形逐漸變?yōu)槎嘟切位蝾悎A形。誘導至第13天時,RT-PCR檢測結(jié)果提示,實驗組細胞高表達ALB、AFP、CY3P4肝細胞相關(guān)基因,而對照組細胞呈低表達及無表達狀態(tài);實驗組細胞PAS染色呈紅色陽性表現(xiàn);細胞免疫組化證實,實驗組細胞高表達肝細胞特異性抗體HepPar-1、AFP、CK18、CK19,與