雞鮑氏志賀氏菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、雞志賀氏菌病是近年發(fā)現(xiàn)的雞的一種新發(fā)傳染病，該病是由雞志賀氏菌引起的一種急性傳染病，可引起不同品種、不同日齡的雞發(fā)生腹瀉，并可導(dǎo)致雛雞死亡。當(dāng)前的研究結(jié)果表明，雞志賀氏菌病流行范圍廣泛，危害嚴(yán)重，其傳播流行給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。又因志賀氏菌可能在人禽間造成交互感染，這就給人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重隱患。因此，對(duì)雞志賀氏菌病展開研究不但具有重要的獸醫(yī)衛(wèi)生學(xué)意義，而且具有重大的醫(yī)學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)意義。
　　 本課題以本實(shí)驗(yàn)室

2、分離鑒定保存的雞鮑氏志賀氏菌為研究材料，在雞鮑氏志賀氏菌疫苗免疫抗體間接ELISA定量檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了雞鮑氏志賀氏菌雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的研究。研究結(jié)果如下：
　　 首先，本研究以雞鮑氏志賀氏菌滅活鋁膠苗免疫健康成年公雞，通過免疫過程中用雞鮑氏志賀氏菌疫苗免疫抗體間接ELISA定量檢測(cè)方法適時(shí)檢測(cè)，獲得高效價(jià)免疫血清。使用飽和硫酸銨法提取雞鮑氏志賀氏菌IgG，并通過DEAE-52離子交換層析進(jìn)行純化。
　　

3、 其次，選用辣根過氧化物酶(HRP)分別以戊二醛兩步法和簡(jiǎn)易過碘酸鈉法對(duì)純化后的雞鮑氏志賀氏菌IgG進(jìn)行標(biāo)記。通過產(chǎn)物檢測(cè)，確定標(biāo)記方法為簡(jiǎn)易過碘酸鈉法，并分離純化酶標(biāo)記物IgG-HRP。
　　 然后，以雞鮑氏志賀氏菌IgG為包被抗體，以雞鮑氏志賀氏菌IgG-HRP為酶標(biāo)抗體，成功建立了檢測(cè)雞鮑氏志賀氏菌的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。并對(duì)雙抗夾心ELISA的最佳工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定：雞鮑氏志賀氏菌抗體包被濃度為5ug

4、/mL，包被最佳條件為4℃12h;最佳封閉條件為每孔100μL1％BSA，37℃封閉1h:待測(cè)抗原與包被抗體的最適反應(yīng)條件為37℃1.5h；酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1:200，最佳工作條件為37℃1h;底物顯色最佳條件為37℃20min。
　　 特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)等結(jié)果表明建立的雞鮑氏志賀氏菌雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。包被的雞鮑氏志賀氏菌IgG與其他易引起腹瀉的病原菌無交叉反