產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌易引發(fā)畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌病，此類病的發(fā)病急、死亡率高，給各國(guó)畜牧業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，且易引起人食物中毒和氣性壞疽，嚴(yán)重影響人們身體健康，因此對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌病的快速診斷尤為重要。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素，它具有細(xì)胞毒性、溶血活性、致死性和皮膚壞死性等特性，因此α毒素是診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌病的重要指標(biāo)，為了對(duì)其進(jìn)行快速、有效檢測(cè)，必須建立準(zhǔn)確、高效、特異的α毒素檢測(cè)技術(shù)。
　　本研究以產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素為檢測(cè)對(duì)象，以抗α毒素

2、單克隆抗體、多克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了雙抗體夾心ELISA(Double Antibody Sandwich ELISA，DAS-ELISA)方法，為α毒素定量監(jiān)測(cè)、后續(xù)研究提供有效工具和基礎(chǔ)。
　　將α毒素重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證后，摸索IPTG最佳誘導(dǎo)條件，表達(dá)出大量包涵體重組α毒素蛋白，經(jīng)Ni-changed Resin鎳柱純化后運(yùn)用SDS-PAGE、Western Blot驗(yàn)證，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，運(yùn)用飽和硫酸銨

3、法純化，并檢測(cè)其效價(jià)和特異性;免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體，正辛酸法純化后，鑒定其特異性、反應(yīng)原性、中和活性等。通過(guò)方針滴定試驗(yàn)選取最佳抗體配對(duì)建立DAS-ELISA方法，對(duì)方法反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　將重組的α毒素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品從1500ng/mL起兩倍系列稀釋至0.73ng/mL，檢測(cè)后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;并對(duì)建立的DAS-ELISA方法進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。DAS-ELISA方法對(duì)α毒素的有效檢測(cè)范圍為5.86～375ng/mL，最低

4、檢測(cè)限為4.57ng/mL;精密度分析表明批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10％，說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性;回收率測(cè)定結(jié)果在97.22％～102.85％范圍內(nèi)，表明該方法準(zhǔn)確性較高;特異性試驗(yàn)表明本方法與β毒素、ε毒素等無(wú)關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，而與天然α毒素和重組α毒素蛋白有特異性反應(yīng)，說(shuō)明本法具有較高的特異性。
　　本方法的初步應(yīng)用結(jié)果顯示，相同培養(yǎng)條件下，A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)上清中，α毒素含量差異較大，A型菌(NC

5、TC8237)中旺毒素含量顯著高于其他菌型;國(guó)外檢測(cè)試劑盒檢測(cè)后可得出α毒素的相同變化趨勢(shì)，但是其無(wú)法定量檢測(cè);本方法比多抗-多抗雙夾心ELISA有更高的特異性和敏感性;檢測(cè)臨床發(fā)病兔子腸內(nèi)容物，結(jié)果與兔魏氏梭菌病臨床病理變化典型程度相對(duì)應(yīng)，病變?cè)矫黠@的兔子，測(cè)得的OD值越高。
　　本研究成功制備了高特異性的單克隆抗體，并建立了特異、靈敏、穩(wěn)定的DAS-ELISA方法，可以檢測(cè)α毒素外源表達(dá)蛋白、培養(yǎng)上清及臨床樣品中的天然毒素，并