馬鈴薯抗晚疫病轉(zhuǎn)基因植株的獲得及其抗病鑒定.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是目前世界上位居第四的糧食作物,也是中國的重要糧、菜作物。馬鈴薯晚疫病是由疫霉菌引起的一種嚴(yán)重性病害,已成為制約馬鈴薯生產(chǎn)的主要因素。
　　 將外源基因通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入受體植物體內(nèi),從而改良植物品種,提高植物抗病蟲害的能力,以達(dá)到提高生物產(chǎn)量的目的,可方便快捷地解決常規(guī)育種無法解決的問題。本研究擬用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決馬鈴薯晚疫病問題,為獲得抗晚疫病的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新品系,構(gòu)建了以草

2、甘膦抗性基因5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase EPSP)為篩選標(biāo)記的蘿卜抗菌肽基因(antifungal protein gene AFP)及花生芪合酶基因(Stilbene synthase gene STS)的植物表達(dá)載體pCAM-EPSPS-AFP及pCAM-EPSPS-STS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,以微型薯薯片為外植體,將蘿卜抗菌肽基

3、因(AFP)及花生芪合酶基因(SIS)導(dǎo)入馬鈴薯栽培品種夏波蒂(Shepody)中。通過草甘膦抗性篩選和PCR檢測(cè)初步鑒定出轉(zhuǎn)蘿卜AFP基因試管苗4株(編號(hào)為A1,A2,A3,A5)及轉(zhuǎn)花生STS基因試管苗4株(編號(hào)為R1,R3,R4,R5)。將轉(zhuǎn)基因陽性植株試管苗通過黑暗誘導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因微型薯,將其在田間種植得到完整的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。
　　 晚疫病菌選用近年來甘肅省馬鈴薯晚疫病優(yōu)勢(shì)小種4.6.7.11,采用離體葉片接種法,鑒定

4、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗晚疫病效果,結(jié)果轉(zhuǎn)蘿卜AFP基因的4個(gè)無性系植株的抗病性均有一定程度的提高且發(fā)病時(shí)間推遲。轉(zhuǎn)花生STS基因的4個(gè)無性系植株R1,R4表現(xiàn)出中度抗病,而R3,R5兩株與對(duì)照相比無顯著差異。
　　 田間馬鈴薯經(jīng)3個(gè)月的生長后成熟,收獲T0代轉(zhuǎn)基因馬鈴薯,其小薯的形態(tài)特征無明顯變化。再經(jīng)薯片鑒定法鑒定其抗晚疫病能力,結(jié)果A1,A3,R1,R4抗病能力有一定的提高,A2,A5,R3,R5與對(duì)照組無明顯差別。將收獲的小薯在

5、4℃保存,3個(gè)月后將其在溫室中播種得到T1代轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株,其形態(tài)特征與野生型無顯著性差異,經(jīng)整株抗病性鑒定后,A1,A2,A3,A5,R1,R4的抗病性有所提高。取田間轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片提取DNA,通過PCR及測(cè)序檢測(cè)證實(shí)蘿卜AFP基因已插入到A1,A2,A3,A5無性系馬鈴薯基因組中。通過PCR及連接測(cè)序證實(shí)花生STS基因已插入到R1,R4植株的基因組中。綜合考慮轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定及分子生物學(xué)鑒定,篩選出4個(gè)抗晚疫病無性系轉(zhuǎn)基