侵染廣東黃秋葵的雙生病毒分子特征及其侵染性克隆構(gòu)建.pdf

1、黃秋葵黃脈曲葉病是我國新發(fā)生的一種由煙粉虱傳播的病害，田間病株典型癥狀表現(xiàn)為植株矮化，葉片向下或向上卷曲，葉質(zhì)脆硬，葉脈黃化，在葉片正面形成網(wǎng)絡(luò)狀，在葉背面葉脈腫大突起明顯，病株幼葉小且向下卷曲，甚至整片幼葉黃化。田間病株率高達60％以上。
　　 本研究對分離自黃秋葵黃脈曲葉病株的病毒分離物分子特征進行了研究，并構(gòu)建了該病毒及其衛(wèi)星分子的侵染性克隆，取得了如下進展：
　　 應(yīng)用雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物

2、AV494和C0PR，對來自廣東的黃秋葵黃脈曲葉病樣進行PCR檢測，結(jié)果顯示，從這些病樣中均能擴增到預(yù)期大小為570bp的特異片段，說明廣東黃秋葵黃脈曲葉病中存在菜豆金色花葉病毒屬病毒。
　　 對分離自廣東黃秋葵黃脈曲葉病株的病毒分離物Okra06基因組進行了克隆及序列分析，結(jié)果表明，該病毒基因組僅含有A組分（DNA-A），不含B組分（DNA-B）；其DNA-A為單鏈環(huán)狀，全長為2737 nt，推導(dǎo)編碼6個ORF，分別是位于病毒

3、鏈上的AVl、AV2及位于互補鏈上的AC1、4C2、AC3和AC4，在AV2與AC1之間的非編碼區(qū)（IR）中含有一個11nt莖和11nt環(huán)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及保守序列TAATATTAC。該組分與木爾坦棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV）分離物G6的同源率最高，為99％；6個ORF與CLCuMV分離物G6的同源率分別為100％、100％、99.6％、99.8％、100％和99.7％。系統(tǒng)進化關(guān)系

4、分析顯示，Okra06與CLCuMV各分離物的親緣關(guān)系最近，聚類在一起形成一個分支，而與其它雙生病毒的親緣關(guān)系相對較遠。這些結(jié)果證明，侵染廣東黃秋葵的病毒分離物Okra06是CLCuMV一個分離物，且該分離物與引起廣東朱槿曲葉病的CLCuMV是同一個株系。
　　 利用菜豆金色花葉病毒屬衛(wèi)星DNA分子（DNAβ）特異引物β01和β02，從分離物Okra06中擴增到1個DNAβ分子。基因克隆與序列分析顯示，該DNAβ全長為1346n

5、t，推導(dǎo)其互補鏈上編碼一個ORF（C1），該序列與CI，CuMV分離物G6 DNAβ的同源率也最高（99％）。系統(tǒng)進化關(guān)系分析結(jié)果表明，Okra06與CLCuMV分離物G6和GX08的DNAβ親緣關(guān)系最近，三者形成一個獨立分支：進一步與CLCuMV、CLCuV的DNAβ聚類成一個較大分支，而與伴隨菜豆金色花葉病毒屬的其它DNAβ親緣關(guān)系相對較遠。
　　 通過基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了CLCuMV-[Okra06]DNA-A侵染性克

6、隆рBinPLUS-1.85A和CLCuMV-[Okra06]DNAβ侵染性克隆рBinPLUS-2β。農(nóng)桿菌注射接種本生煙的結(jié)果顯示，рBinPLUS-1.85A單獨接種的植株不表現(xiàn)明顯癥狀，但PCR可檢測到CLCuMV-[Okra06]的存在，說明該病毒可以系統(tǒng)侵染本生煙但癥狀不明顯；рBinPLUS-2β單獨接種植株表現(xiàn)輕微的曲葉癥狀，但在接種植株中PCR未檢測DNAβ分子的存在，說明DNAβ依賴病毒DNA-A才能復(fù)制；而兩者共同