鈣庫操控的鈣離子通道在糖尿病大鼠膀胱收縮功能中作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建不同時間段STZ誘導(dǎo)的DM大鼠動物模型。通過激活或失活SOCCs通道，運用離體逼尿肌肌條收縮實驗來研究SOCCs在DCP疾病中對膀胱肌條收縮功能的作用。通過原代逼尿肌細胞分離培養(yǎng)，培養(yǎng)出原代逼尿肌細胞。采用SOCCs的激活劑和抑制劑，研究激活或失活該通道后，DM大鼠膀胱逼尿肌細胞鈣離子濃度的變化。并研究不同糖尿病病程作用下，大鼠膀胱中SOCCs關(guān)鍵分子STIM1和Orai1的mRNA水平和蛋白水平表達的改變情況。<

2、br>　　方法:
　　1.6-8周雌性S-D大鼠70只，按年齡分為每組10只，其中正常對照組（normal control，N組）4組，實驗組（diabetes mellitus,DM組）3組。DM組：單次腹腔注射pH4.5，0.1mmol/L的檸檬酸緩沖液溶解的鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ），50mg/kg。N組：單次腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。具體分組：
　　DM組：
　?。?）4周實驗組（D

3、M4W組）：注射STZ，成模后4周處死。
　?。?）8周實驗組（DM8W）：注射STZ，成模后8周處死。
　?。?）12周實驗組（DM12W）：注射STZ，成模后12周處死。
　　N組：
　?。?）0周對照組（N0）：注射緩沖液后3天后處死。
　?。?）4周對照組（N1）：注射緩沖液后4周后處死。
　?。?）8周對照組（N2）：注射緩沖液后8周后處死。
　?。?）12周對照組（N3）：注射緩沖液

4、后12周后處死。
　　注射藥物3天后測量隨機血糖三次，血糖值均大于16.7mmol/L，認為DM模型構(gòu)建成功。其后觀察處死時血糖，大鼠體重等指標變化，并留取膀胱組織進行HE染色，評估膀胱組織學改變。
　　2.分別制備8*3*3mm離體逼尿肌肌條，解剖顯微鏡下去除膀胱粘膜及漿膜層，置于kreb’s液中，通過給予環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic Acid,CPA)激活SOCCs和SKF-96365抑制SOCCs來觀察各組離

5、體逼尿肌肌條收縮頻率和收縮幅度的變化。
　　3.采用酶消化法來分離逼尿肌細胞進行原代細胞培養(yǎng)。具體使用膠原蛋白酶Ⅱ4mg/ml及牛血清白蛋白（BSA）4mg/ml，在37℃，5％CO2的條件下消化40-60分鐘。觀察所獲得細胞形態(tài)、生長方式及α-SMA免疫熒光法檢測平滑肌細胞特異性。
　　4.分離培養(yǎng)24h的原代逼尿肌細胞負載Fluo-4AM，通過激活和失活SOCCs通道，在激光共聚焦顯微鏡下觀察和記錄各組逼尿肌細胞熒光強度

6、的變化，最后計算實測熒光強度（F1）比背景熒光強度(F0)的變化，即采用F1/F0來進行比較在SOCCs激活和失活后，各組細胞鈣離子的變化。
　　5.RT-qPCR法和Western Blot法測定不同時間DM大鼠膀胱組織STIM1和Orai1分子的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.DM組大鼠血糖均大于16.7mmol/l，體重連續(xù)降低，與對照組對比，DM組大鼠體重下降具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），膀胱擴張明顯，可見膀

7、胱尿潴留，血糖也明顯增高（p＜0.05）。HE染色提示隨著糖尿病進展，DM組逼尿肌細胞增生，肥大，纖維組織排列紊亂，間質(zhì)疏松。
　　2.加入CPA和SKF-96365后離體膀胱逼尿肌肌條收縮頻率變化：
　　加入CPA后，所有實驗組肌條收縮頻率均增加。與對照組比較，DM4W組和DM8W組肌條收縮頻率明顯增加（DM4W vs N1：t=3.776,p=0.002；DM8W vs N2：t=2.282,p=0.039）。DM三組實

8、驗組之間比較，DM4W組與DM12W，DM8W組與DM12W，均表現(xiàn)為收縮頻率增強（DM12W vs DM4W,p=0.039;DM12W vs DM8W,p=0.012），各個時間正常組間比較，無統(tǒng)計學意義。加入SKF-96365后，所有實驗組肌條收縮頻率降低。與對照組比較，DM4W和DM8W組肌條收縮頻率仍較高（DM4W vs N1：t=-3.750,p=0.02；DM8W vs N2：t=-2.593,p=0.021）DM三組之間

9、比較，DM12W組較其他兩組明顯高（DM12W vs DM4W,p=0.004;DM12W vs DM8W,p=0.021），具有統(tǒng)計學意義，各個時間正常組間比較，無統(tǒng)計學意義。
　　3.加入CPA和SKF-96365后離體膀胱逼尿肌肌條收縮幅度變化：
　　在所有實驗組中加入 CPA后，逼尿肌肌條收縮幅度均下降；在加入SKF-96365后，收縮幅度均有所回升，但仍小于沒加藥前。各組之間逼尿肌肌條收縮幅度比較，差異不明顯，沒有

10、統(tǒng)計學意義。
　　4.成功分離培養(yǎng)出膀胱逼尿肌細胞，細胞3-5天逐漸融合顯片狀生長，7天左右平滑肌融合達到80%以上。細胞呈平滑肌細胞典型的“峰-谷”樣生長，α-SMA免疫熒染色陽性。
　　5.加入CPA后，激活SOCCs，所有實驗組逼尿肌細胞相對熒光強度均增加，DM4W、DM8W與對照組比較相對熒光強度顯著增強（DM4W vs N1：t=4.867, p=0.0002；DM8W vs N2：t=4.203,p=0.001）

11、，DM組之間比較，DM12W較其他兩組明顯降低(DM12W vs DM4W,p=0.001; DM12W vs DM8W,p=0.0004,DM8W vs DM4W,p=0.680），具有統(tǒng)計學意義。加入SKF-96365后，SOCCs失活，細胞相對熒光強度降低，與對照組比較DM4W, DM8W的熒光相對強度仍顯著高于對照組（DM4W vs N1：t=3.141,p=0.007；DM8W vs N2：t=3.871,p=0.002），D

12、M組之間比較，DM12W較其他兩組明顯降低（DM12W vs DM4W,p=0.003;DM12W vs DM8W,p=0.002,DM8W vs DM4W,p=0.914）。
　　6.在DM4W和DM8W組中，與對照組比較，Orai1mRNA和蛋白表達量顯著增加（mRNA：DM4W vs N1：t=6.049,p=0.0001；DM8W vs N2：t=4.122, p=0.002蛋白：DM4W vs N1：t=8.862,p=

13、0.001;DM8W vs N2：t=10.803,p=0.0004）。STIM1 mRNA表達量在DM4W組中顯著增加（t=2.799,p=0.019），STIM1蛋白表達量在DM4W和DM8W組中顯著增加（DM4W vs N1：t=6.540, p=0.003;DM8W vs N2：t=3.495）。DCP不同時間比較，Orai1mRNA的表達量在DM12W組中與其他DM組比較明顯降低（DM12W vs DM4W,p=0.0001;

14、 DM12W vs DM8W,p=0.001, DM8W vs DM4W,p=0.329）；Orai1蛋白表達量也明顯降低（DM12W vs DM4W,p=0.007;DM12W vs DM8W,p=0.011, DM8W vs DM4W,p=0.717）。STIM1mRNA的表達量在DM4W組中較其他 DM組明顯增加（DM4W vs DM8W,p=0.013;DM4W vs DM12W, p=0.002, DM8W vs DM12W,

15、p=0.409），而STIM1蛋白表達量在DM三組間均不同（DM12W vs DM4W,p=0.0003;DM12W vs DM8W,p=0.003,DM8W vs DM4W,p=0.046）。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立SZT誘導(dǎo)的DM大鼠模型。在DCP疾病中，SOCCs參與調(diào)節(jié)了膀胱逼尿肌的收縮功能，SOCCs對膀胱逼尿肌收縮頻率調(diào)節(jié)作用增強。
　　2.采用酶消化法成功分離培養(yǎng)了膀胱逼尿肌細胞，SOCCs參與了