血小板微粒促進(jìn)血管新生的作用和機(jī)制研究.pdf

1、血管新生在整個(gè)生命過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用，與胚胎發(fā)育、傷口愈合、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)定、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過(guò)程都密切相關(guān)。廣義的血管新生，又叫血管形成(vascularization)，主要包括三種形式:血管生成(vasculogenesis)、血管新生(angiogenesis)和動(dòng)脈形成(arteriogenesis)。其中血管新生(angiogenesis)是在既已存在的血管基礎(chǔ)上，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖、遷移等最

2、終以“出芽”的形式實(shí)現(xiàn)血管叢的擴(kuò)張。血管內(nèi)皮細(xì)胞除參與形成基本的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外，亦能分泌多種因子，形成特定的組織和細(xì)胞微環(huán)境，調(diào)節(jié)組織生長(zhǎng)和修復(fù)。血小板是參與血管病變的重要細(xì)胞成分。血小板到達(dá)損傷的內(nèi)皮部位后迅速被激活，釋放出大量的血小板微粒(platelet microvesicles，PMVs)。PMVs是一群直徑為0.1-1.0μm大小的超微膜性囊泡，擁有與血小板類(lèi)似的重要生物學(xué)功能，涉及體內(nèi)多種生理和病理反應(yīng)。近年來(lái)有研究顯示，

3、PMVs還可通過(guò)攜帶多種促血管生成因子(VE GF、PDGF、bFGF等)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化，促進(jìn)血管新生。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白5(staphylococcal superantigen-like protein5，SSL5)激活產(chǎn)生的PMVs可以促進(jìn)單核細(xì)胞中炎癥因子（IL-1β、TNFα、MCP-1及MMP-9）的表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。因此，推測(cè)PMVs調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)

4、胞分泌譜的改變可能是其參與血管新生的另外一種新機(jī)制，旨在為更加全面地了解和認(rèn)識(shí)血小板功能提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)也為探索血管新生相關(guān)疾病的防治奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.體外制備凝血酶受體活化肽6(thrombin receptor activator peptide6，TRAP-6)激活的PMVs，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定，BCA法進(jìn)行定量。培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endotheli

5、al cells，HUVECs)，臺(tái)式液作為空白對(duì)照(Con)，PMVs制備過(guò)程中的上清液作為溶劑對(duì)照(Sup)，利用基質(zhì)膠管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PMVs對(duì)HUVECs成管能力的影響;CCK8法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移狀況。
　　2.培養(yǎng)HUVECs，臺(tái)式液作為空白對(duì)照，PMVs制備過(guò)程中的上清液作為溶劑對(duì)照，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PMVs對(duì)HUVECs相關(guān)促血管生成因子(HIF-1a、VE

6、GF-A、FGF-2、IL-8、MMPs)mRNA表達(dá)的影響，Western Blot檢測(cè)MMPs的蛋白表達(dá)水平，明膠酶譜法檢測(cè)MMPs的活性。同時(shí)利用抑制劑干擾MMPs的活性，以及CD40L、CD40和P-選擇素的中和性抗體干擾PMVs與HUVECs間CD40L/CD40和P-選擇素/PSGL-1的結(jié)合，研究其對(duì)HUVECs成管能力及遷移的影響。
　　3.采用6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠，于小鼠皮下注入基質(zhì)膠栓，在體研究P

7、MVs的促血管新生作用。
　　結(jié)果：
　　1.PMVs在體外具有顯著的促血管新生效應(yīng)。
　?、貾MVs較Con與Sup，可顯著增強(qiáng)HUVECs的成管能力，且呈劑量效應(yīng);
　?、赑MVs較Con可顯著促進(jìn)HUVECs的增殖，但其促增殖效應(yīng)與Sup相當(dāng)，不呈劑量依賴(lài)性;
　　③PMVs較Con與Sup，呈劑量依賴(lài)性地促進(jìn)HUVECs的遷移。
　　2.PMVs體外促血管新生的機(jī)制。
　?、貾MVs對(duì)于

8、HUVECs促血管生成相關(guān)因子(HIF-1α、VEGF-A、FGF-2、MMP-7、TIMP-1)mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響;但可呈劑量依賴(lài)性地抑制IL-8mRNA的表達(dá);
　?、赑MVs較Con與Sup，可顯著促進(jìn)HUVECs表達(dá)和分泌MMP-2/9，并增強(qiáng)其活性，呈劑量依賴(lài)關(guān)系;
　?、跰MPs全抑制劑GM6001可以明顯抑制PMVs對(duì)HUVECs的促成管和促遷移效應(yīng);
　　④MMP-2特異性抑制劑抑制PMVs促成管和

9、促遷移能力的作用強(qiáng)于MMP-9特異性抑制劑;
　?、軨D40L-CD40與P-selectin-PS GL-1的相互作用并不參與PMVs的促血管新生過(guò)程。
　　3.PMVs促進(jìn)體內(nèi)血管新生的作用和相關(guān)機(jī)制
　　①PMVs在體內(nèi)具有顯著的促血管新生效應(yīng);
　?、贛MPs全抑制劑GM6001可顯著抑制PMVs在體內(nèi)的促血管新生效應(yīng);此外，MMP-2特異性抑制劑的效果明顯優(yōu)于MMP-9特異性抑制劑。
　　結(jié)論：<

10、br>　　PMVs在體內(nèi)外均具有顯著的促血管新生效應(yīng)。同時(shí)，PMVs的促增殖作用雖與Sup（溶劑對(duì)照）相當(dāng);但誘導(dǎo)遷移能力更加顯著，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。在機(jī)制方面，PMVs主要通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2/9的表達(dá)，并上調(diào)其活性，降解細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，最終促進(jìn)血管新生;其中MMP-2發(fā)揮的作用可能更大。本研究闡述了PMVs參與血管新生的一種新機(jī)制，以期能更加全面地了解和認(rèn)識(shí)血小板功能，同時(shí)為血管新生相關(guān)疾病的防治奠定基礎(chǔ)。