血小板對血管內皮瘤生長的促進作用及其作用機制.pdf

1、背景：
　　血管內皮瘤（Hemangioendothelioma, HE）是血管病變的一種類型，它具有血管內皮細胞的增殖的特征。它包括一系列的臨床表現(xiàn)和組織學特征?？úㄎ鳂友軆绕ち鍪且环N特殊的血管內皮瘤類型，它經常發(fā)生卡－梅綜合征（Kasabach–Merritt syndrome，KMS），以嬰幼兒血小板降低導致的凝血功能障礙為特征。許多研究為了驗證各種細胞因子的治療可能性，用小鼠血管內皮瘤細胞系（Mouse Hemangio

2、endothelioma Endothelial Cells, EOMA cells）來高度模擬血管內皮瘤的環(huán)境。已被證明血小板在血管生成時能支持正常和異常內皮細胞的生長。腫瘤細胞能誘導血小板激活并釋放細胞內不同顆粒里的營養(yǎng)因子，以支持內皮細胞的存活和生長。整合素β3，血小板質膜上富含的一種糖蛋白，在血小板－內皮直接接觸中起重要作用，可介導內皮細胞增殖和血管生成。此外，內皮細胞可能通過吞噬血小板對其本身發(fā)揮促血管生成及抑制凋亡的作用。<

3、br>　　目的：
　　利用小鼠內皮細胞來源的EOMA細胞系為模型來探討血小板是否能促進血管內皮瘤的增殖及其內在的作用機制。
　　方法：
　　⑴把血小板從小鼠血液中提取出來，然后與EOMA細胞系（已被廣泛接受的小鼠血管內皮瘤細胞模型）或作為對照的小鼠腦微血管內皮細胞系（mousebrain microvascular endothelial cells，MBMECs）共培養(yǎng)。然后用CCK8試驗來檢測EOMA細胞系和MBM

4、ECs的活力。⑵用Annexin V/PI試驗來評估與血小板共培養(yǎng)之后的EOMA細胞系及MBMECs的凋亡情況。⑶用EdU試驗來檢測與血小板共培養(yǎng)之后的細胞DNA的合成，這是一種細胞增殖的標志。⑷為了明確血小板是否被內皮細胞所激活，將EOMA細胞系或其上清液處理血小板，然后分析血小板表面CD62P的表達，這是一種血小板被激活的標志。接著用小鼠血管生成蛋白芯片來檢測血小板與EOMA細胞系共培養(yǎng)之后所釋放的血管生成因子。用中和抗體阻止EOM

5、A細胞Tie-2受體的激活后，將這些細胞與血小板共培養(yǎng)之后用CCK8試驗檢測細胞的活力。⑸將EOMA細胞系及MBMECs分別與CFSE標記的血小板共培養(yǎng)之后，用免疫熒光染色和流式細胞術來評估血小板的吞噬率。⑹用蛋白免疫印跡法來檢測EOMA的整合素β3水平以及PI3K/Akt/NF-κB通路。⑺通過整合素β3的siRNA敲除β3之后，用蛋白免疫印跡法來檢測磷酸化的Akt水平。⑻將血小板與β3敲除或Akt抑制的EOMA共培養(yǎng)，然后用CCK8

6、試驗來檢測細胞活力，用EdU試驗來評價細胞增殖情況。⑼將預先用β3敲除或Akt抑制劑GSK690693抑制的EOMA細胞皮下注射到C57BL/6J小鼠體內，注射后7天，測量腫瘤的重量和體積。
　　結果：
　?、貱CK8試驗表明EOMA細胞系與血小板共培養(yǎng)72小時后與對照組相比活力提升到了約125％，然而MBMEC細胞的活力并未受到影響。②細胞與血小板共培養(yǎng)24或48小時后，我們發(fā)現(xiàn)暴露于血小板處理后，活細胞、早期凋亡細胞或晚

7、期凋亡細胞數(shù)都無明顯變化。③將細胞與血小板共培養(yǎng)24及48小時后，EdU對EOMA細胞核的結合率與對照組相比明顯增加，分別增加到了150%和200%。但是血小板并沒有引起EdU對MBMECs細胞核的結合增加。④血小板與EOMA細胞共培養(yǎng)24小時后，表面的CD62P并沒有明顯升高。除了促血管生成因子中的血管生成因子-1（Angiopoietin-1，Ang-1）和抑血管生成因子血小板因子-4（Platelet factor4，PF-4）外

8、，相對于對照組我們并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的血小板釋放的血管生成因子增加。阻斷Tie-2受體并沒有阻止血小板對EOMA細胞活力的增加。⑤使用免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)EOMA細胞系及正常的MBMECs都對血小板有一個較低的吞噬率。同時，我們用流式細胞術來檢測共培養(yǎng)20小時之后的CFSE熒光強度，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比這個熒光強度的增加幾乎不能被檢測到。⑥EOMA與血小板共培養(yǎng)之后，整合素β3水平明顯升高，并具有時間依賴性，同時細胞與血小板短時間共培養(yǎng)后

9、，磷酸化的Akt明顯增多。這種血小板處理后的磷酸化的Akt增多，可通過siRNA敲除，抑制整合素β3水平來阻斷。通過CCK8及EdU試驗，我們發(fā)現(xiàn)通過敲除整合素β3以及Akt抑制劑GSK690693抑制，可進一步降低血小板對EOMA細胞生存的支持作用。⑦與對照組相比，抑制了整合素β3表達的EOMA細胞系生長成了較小的腫瘤組織，腫瘤體積和腫瘤重量都有所減小。此外，皮下注射的用GSK690693處理的EOMA細胞系與沒有處理的對照組相比也生