血小板對(duì)血管內(nèi)皮瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用及其作用機(jī)制.pdf

1、背景：
　　血管內(nèi)皮瘤（Hemangioendothelioma, HE）是血管病變的一種類型，它具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的特征。它包括一系列的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)特征?？úㄎ鳂友軆?nèi)皮瘤是一種特殊的血管內(nèi)皮瘤類型，它經(jīng)常發(fā)生卡－梅綜合征（Kasabach–Merritt syndrome，KMS），以嬰幼兒血小板降低導(dǎo)致的凝血功能障礙為特征。許多研究為了驗(yàn)證各種細(xì)胞因子的治療可能性，用小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞系（Mouse Hemangio

2、endothelioma Endothelial Cells, EOMA cells）來(lái)高度模擬血管內(nèi)皮瘤的環(huán)境。已被證明血小板在血管生成時(shí)能支持正常和異常內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)血小板激活并釋放細(xì)胞內(nèi)不同顆粒里的營(yíng)養(yǎng)因子，以支持內(nèi)皮細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。整合素β3，血小板質(zhì)膜上富含的一種糖蛋白，在血小板－內(nèi)皮直接接觸中起重要作用，可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成。此外，內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)吞噬血小板對(duì)其本身發(fā)揮促血管生成及抑制凋亡的作用。<

3、br>　　目的：
　　利用小鼠內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的EOMA細(xì)胞系為模型來(lái)探討血小板是否能促進(jìn)血管內(nèi)皮瘤的增殖及其內(nèi)在的作用機(jī)制。
　　方法：
　　⑴把血小板從小鼠血液中提取出來(lái)，然后與EOMA細(xì)胞系（已被廣泛接受的小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞模型）或作為對(duì)照的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系（mousebrain microvascular endothelial cells，MBMECs）共培養(yǎng)。然后用CCK8試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)EOMA細(xì)胞系和MBM

4、ECs的活力。⑵用Annexin V/PI試驗(yàn)來(lái)評(píng)估與血小板共培養(yǎng)之后的EOMA細(xì)胞系及MBMECs的凋亡情況。⑶用EdU試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)與血小板共培養(yǎng)之后的細(xì)胞DNA的合成，這是一種細(xì)胞增殖的標(biāo)志。⑷為了明確血小板是否被內(nèi)皮細(xì)胞所激活，將EOMA細(xì)胞系或其上清液處理血小板，然后分析血小板表面CD62P的表達(dá)，這是一種血小板被激活的標(biāo)志。接著用小鼠血管生成蛋白芯片來(lái)檢測(cè)血小板與EOMA細(xì)胞系共培養(yǎng)之后所釋放的血管生成因子。用中和抗體阻止EOM

5、A細(xì)胞Tie-2受體的激活后，將這些細(xì)胞與血小板共培養(yǎng)之后用CCK8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力。⑸將EOMA細(xì)胞系及MBMECs分別與CFSE標(biāo)記的血小板共培養(yǎng)之后，用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估血小板的吞噬率。⑹用蛋白免疫印跡法來(lái)檢測(cè)EOMA的整合素β3水平以及PI3K/Akt/NF-κB通路。⑺通過(guò)整合素β3的siRNA敲除β3之后，用蛋白免疫印跡法來(lái)檢測(cè)磷酸化的Akt水平。⑻將血小板與β3敲除或Akt抑制的EOMA共培養(yǎng)，然后用CCK8

6、試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力，用EdU試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況。⑼將預(yù)先用β3敲除或Akt抑制劑GSK690693抑制的EOMA細(xì)胞皮下注射到C57BL/6J小鼠體內(nèi)，注射后7天，測(cè)量腫瘤的重量和體積。
　　結(jié)果：
　　①CCK8試驗(yàn)表明EOMA細(xì)胞系與血小板共培養(yǎng)72小時(shí)后與對(duì)照組相比活力提升到了約125％，然而MBMEC細(xì)胞的活力并未受到影響。②細(xì)胞與血小板共培養(yǎng)24或48小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)暴露于血小板處理后，活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞或晚

7、期凋亡細(xì)胞數(shù)都無(wú)明顯變化。③將細(xì)胞與血小板共培養(yǎng)24及48小時(shí)后，EdU對(duì)EOMA細(xì)胞核的結(jié)合率與對(duì)照組相比明顯增加，分別增加到了150%和200%。但是血小板并沒(méi)有引起EdU對(duì)MBMECs細(xì)胞核的結(jié)合增加。④血小板與EOMA細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，表面的CD62P并沒(méi)有明顯升高。除了促血管生成因子中的血管生成因子-1（Angiopoietin-1，Ang-1）和抑血管生成因子血小板因子-4（Platelet factor4，PF-4）外

8、，相對(duì)于對(duì)照組我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的血小板釋放的血管生成因子增加。阻斷Tie-2受體并沒(méi)有阻止血小板對(duì)EOMA細(xì)胞活力的增加。⑤使用免疫熒光染色，我們發(fā)現(xiàn)EOMA細(xì)胞系及正常的MBMECs都對(duì)血小板有一個(gè)較低的吞噬率。同時(shí)，我們用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)共培養(yǎng)20小時(shí)之后的CFSE熒光強(qiáng)度，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比這個(gè)熒光強(qiáng)度的增加幾乎不能被檢測(cè)到。⑥EOMA與血小板共培養(yǎng)之后，整合素β3水平明顯升高，并具有時(shí)間依賴性，同時(shí)細(xì)胞與血小板短時(shí)間共培養(yǎng)后

9、，磷酸化的Akt明顯增多。這種血小板處理后的磷酸化的Akt增多，可通過(guò)siRNA敲除，抑制整合素β3水平來(lái)阻斷。通過(guò)CCK8及EdU試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)敲除整合素β3以及Akt抑制劑GSK690693抑制，可進(jìn)一步降低血小板對(duì)EOMA細(xì)胞生存的支持作用。⑦與對(duì)照組相比，抑制了整合素β3表達(dá)的EOMA細(xì)胞系生長(zhǎng)成了較小的腫瘤組織，腫瘤體積和腫瘤重量都有所減小。此外，皮下注射的用GSK690693處理的EOMA細(xì)胞系與沒(méi)有處理的對(duì)照組相比也生