血小板介導(dǎo)腫瘤血管形成和穩(wěn)定性的機制研究.pdf

1、目的:血小板在止血中發(fā)揮重要作用,有研究顯示其參與腫瘤細胞的血行擴散。大量的血小板在腫瘤血管外的微環(huán)境中被檢測到。然而,目前尚不清楚是否血管外的血小板與腫瘤細胞的相互作用在腫瘤的生長、血管生成及轉(zhuǎn)移啟動中發(fā)揮作用。本研究將對血小板是否通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞遷移進入血管進而增加腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲展開研究。
　　方法:1.體外部分:采用改良的3-D遷移實驗就血小板對腫瘤細胞的侵襲性進行探討。B16/F10與血小板按照1:1000

2、的比例混勻,懸浮于matrigel,加入遷移板上層小室,下層24孔板每孔加入DMEM600μL(含2.5％FBS),37℃,5%CO2培養(yǎng)72小時,取出上層小室,以消毒棉簽輕輕拭去半透膜上層小腔內(nèi)的matrigel,半透膜下表面以結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)遷移的腫瘤細胞。每個孔隨機取5個視野計數(shù),結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。2.體內(nèi)部分:(1)移植性腫瘤模型的建立:小鼠以戊巴比妥鈉麻醉,1×106B16/F10混懸于基質(zhì)膠(80%)接種于小鼠

3、背部(已用脫毛膏去毛)(共培養(yǎng)組:血小板與腫瘤細胞1000:1混勻后37℃孵育30min后接種),每3天用游標卡尺測量一次腫瘤大小,腫瘤大小=長×寬2×0.52。小鼠在接種后第24天處死。(2)血小板減少的誘導(dǎo):待C57小鼠的B16/F10腫瘤大小長至約500mm3,腹腔注射小鼠血小板減少抗體(polyclonalanti-mouseGPIbαratIgG),3天/次,2.5μg/g體重。對照組腹腔注射IgG(nonimmuneratp

4、olyclonalIgG)。以血小板計數(shù)來評價血小板減少模型是否建立。(3)微透析:麻醉小鼠,將微透析探針(CMA/20,0.5mmdiameter)插入腫瘤組織,連于CMA/102微透析泵(CMA/Microdialysis),以154mmol/LNaCl(含40mg/mLdextran),速度0.6μL/min進行透析,透析液以冰浴收集,保存于-80℃用于后續(xù)實驗。(4)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的定量:以HE染色石蠟包埋的肺組織,顯微鏡下觀察雙肺

5、,計數(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),轉(zhuǎn)移面積占全肺的比例以NIHImageJsoftware進行分析。(5)腫瘤缺氧分析:小鼠處死前2h腹腔注射哌莫硝唑(hydro-chochloride),哌莫硝唑復(fù)合物將按照廠家的方法使用Hypoxyprobe-1-Mab1抗體進行免疫組化分析。圖像以Leica(DM750)顯微鏡采集。每個標本至少分析3張切片,每張切片3個不同的視野。(6)統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析,P<0.05為差異具有

6、統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.血小板與腫瘤細胞共培養(yǎng)促進腫瘤細胞的侵襲能力。在改良的3D侵襲實驗中,血小板與腫瘤細胞共培養(yǎng)組較對照組腫瘤細胞的侵襲能力明顯增強。2.GPIbα抗體可有效抑制小鼠血小板數(shù)量:腹腔注射GPIbα抗體2.5μg/g體重,在注射后12h即可引起小鼠循環(huán)中的血小板數(shù)量減少95%以上。小鼠每3天注射1次抗體可維持血小板減少狀態(tài)。3.減少血小板不改變腫瘤大小,但降低腫瘤肺轉(zhuǎn)移:在接種后第24天,與對照組相比,血小板

7、減少組腫瘤大小(2777±300mm3Vs.2956±180mm3,P>0.05)和腫瘤重量(4.204±0.67gVs.3.943±0.63g,P>0.05)均無明顯改變,但進一步檢查雙肺轉(zhuǎn)移情況發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移明顯減少。4.減少血小板明顯減少腫瘤血管密度和降低血管成熟性:由于血小板釋放顆粒釋放的促血管生成因子可能影響腫瘤血管形成,我們使用anti-PECAM-1和anti-α–SMA雙染法檢查了腫瘤組織血管密度和覆蓋率。血小板減少組的PE

8、CAM-1-positive毛細血管密度明顯低于對照組。腫瘤內(nèi)的毛細血管覆蓋率(α–SMA-positive的壁細胞)亦明顯少于對照組。5.減少血小板降低腫瘤缺血和HIF-1α表達:為了更好地探尋血小板減少導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制,我們首先通過檢查腫瘤組織中哌莫硝唑復(fù)合物的生成評價了缺氧水平,結(jié)果顯示血小板減少組的缺氧明顯低于對照組。此外,缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α表達明顯低于對照組。6.血小板與腫瘤細胞共培養(yǎng)促進腫瘤生長和腫瘤轉(zhuǎn)移:

9、血小板與腫瘤細胞B16/F10以1000:1的比例混懸共培養(yǎng)(37℃,5%CO2)30min后接種于小鼠背部,同時設(shè)未共培養(yǎng)的對照組。待腫瘤生長24天后,共培養(yǎng)組的腫瘤大小(3968±296mm3Vs.2956±180mm3,P<0.05)和腫瘤重量(5.529±0.35gVs.3.943±0.74g,P<0.05)明顯大于對照組,且腫瘤的肺轉(zhuǎn)移明顯增加。通過檢查腫瘤組織中哌莫硝唑復(fù)合物的生成評價了缺氧水平,結(jié)果顯示共培養(yǎng)組的缺氧明顯高

10、于對照組。7.血小板改變腫瘤內(nèi)的血管生成因子水平:在處死小鼠的前一天對腫瘤組織進行微透析,透析液以VEGF-Elisa試劑盒進行定量分析,結(jié)果顯示血小板減少組的VEGF明顯低于對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.血小板促進腫瘤細胞的遷移,即增強腫瘤細胞的侵襲性。2.血液循環(huán)中的血小板在腫瘤的生長和侵襲中扮演了重要角色,不改變腫瘤的大小,但是促進腫瘤轉(zhuǎn)移。3.腫瘤微環(huán)境中血小板與腫瘤細胞的粘附增加腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。4.血小板減少