西瓜果實含糖量QTL定位及糖轉運蛋白基因功能初析.pdf

1、西瓜作為一種以鮮食為主的水果，果實含糖量是評價西瓜品質的最核心指標，一直是西瓜品種改良與栽培中最為重要的目標性狀。然而，西瓜含糖量是由多基因控制的復雜數量性狀，并存在明顯的環(huán)境互作效應，傳統(tǒng)的生理與遺傳學研究方法很難分析其遺傳本質與調控機制，進一步明確在復雜的糖代謝和糖轉運基因網絡中哪些節(jié)點是影響和決定西瓜果實糖積累的關鍵基因，不僅可為西瓜品質改良提供理論與技術指導，而且也為探索作物光合產物積累與轉運的分子機制奠定堅實基礎，因此本項目研

2、究具有重要理論意義與實用價值。本文通過構建高密度SNP遺傳圖譜與全基因組關聯分析（GWAS）方法，完成含糖量性狀QTL精細定位，試圖明確西瓜含糖量遺傳控制位點。在此基礎上，對QTL區(qū)域的糖轉運蛋白基因的結構變異、表達模式、亞細胞定位、功能驗證和調控機制進行了初步分析，取得的主要研究結果如下。
　　1．西瓜整合圖譜構建及含糖量QTL初定位。利用4個獨立的遺傳群體構建了一張整合圖譜。4個獨立的遺傳群體分別為：東亞栽培種97103和野生

3、種PI296341-FR雜交單粒傳構建的103株系重組自交系（RILs）；北美栽培種ZWRM50×野生種PI244019(ZWRM×citron)雜交構建的182單株的F2群體；164株系的栽培種×栽培種[Klondike Black Seeded×New Hampshire Midget(KBS×NHM)] RIL群體；187單株的栽培種×半野生種[Strain II×PI560023(SII×egusi)] F2群體。該整合圖共計包

4、含標記1339個，遺傳距離798cM，平均標記間距0.6cM。整合圖譜共計包含58個已經發(fā)表的QTL和12個新發(fā)現的QTL，其中新發(fā)現的QTL包括西瓜折光糖含量（Brix）、果糖（Fru）、蔗糖（Suc）和葡萄糖（Glu）含量QTL。通過整合圖譜將西瓜折光糖含量主效QTL（Brix）定位于chr2(QBRIX2-1、QBRIX2-2及QBRIX2-3)，該3個主效QTL均與果糖含量QTL(QFRU2-1、QFRU2-2和QFRU2-3)

5、重合。其中2個QTL(QBRIX2-1和QBRIX2-3)與蔗糖含量QTL（QSUC2-1和QSUC2-2）重合。通過整合比較分析不同群體下定位的含糖類QTL發(fā)現QBRIX2-1, QBRIX2-2及QBRIX2-3均能在不同遺傳背景下被檢測到，且位于整合圖譜同一區(qū)間，表明這些QTL能夠解釋廣泛背景下的遺傳變異。
　　2．RIL重測序SNP圖譜構建與含糖量QTL精細定位。對栽培西瓜97103與野生西瓜PI296341-FR為親本構

6、建的RIL群體96個單系進行了重測序。從94.7萬個SNP位點選取高質量的SNP構建2777 Bin，利用2777 Bin構建RIL SNP Bin遺傳圖，SNP遺傳圖共計包含SNP Bin2539個，遺傳距離總1565.0cM。利用超高密度RIL SNP Bin遺傳圖，將97103基因組386個scaffolds大約344 Mb(占組裝基因組355.2Mb的96.9％)錨定到西瓜11條染色體，共計有314 scaffolds(332.

7、6 Mb)大約占93.6%組裝序列確定方向，較西瓜基因組發(fā)表版本僅65%的scaffold確定方向有明顯提高。通過超高密度RIL SNP Bin圖將西瓜含糖量QBRIX2-1和QBRIX2-2分別精細定位在125 Kb（16 genes）和797 Kb(20 genes)之間。利用和高糖親本97103遺傳相似度高達84.3%的RIL-G35與97103構建BC2F2近等基因系群體將QBRIX2-3進一步定位到Indel標記WMI251和

8、WMI233之間，包含87個基因，其中有6個轉錄因子，其中bHLH家族轉錄因子998在親本97103和PI296341中存在蛋白差異且判斷為有害突變，可能會影響基因功能。
　　3．QBRIX2-1區(qū)間轉運蛋白基因835轉錄水平、結構變異、組織特異性表達及其與QBRIX2-3的互作模式解析。含糖量QBRIX2-1精細定位在125 Kb之間，涉及到16個候選基因。轉錄組分析發(fā)現僅一個MSF家族轉運蛋白基因835在高糖材料97103果實

9、成熟4個關鍵時期高量上調表達，而在低糖材料PI296341果實成熟4個關鍵時期無表達，在97103果皮、根和葉部也呈低表達，Q-PCR檢測約50份典型重測序材料835表達發(fā)現其表達量與含糖量正相關，確定為QBRIX2-1的候選基因。RACE擴增835在高糖材料和低糖材料中全長CDS及5’和3’端序列發(fā)現835在高糖材料5’UTR區(qū)up37bp存在一個SNP（A/C），可導致高糖材料和低糖材料翻譯框架改變：高糖材料減少45個氨基酸。檢測該

10、SNP在130份重測序材料中發(fā)現Brix大于4的材料均為A，而低于4的材料均為 C，不僅可區(qū)分栽培和野生種之間糖分差異，還能有效區(qū)分半野生資源內部高糖和低糖材料，因此該SNP可作為自然群體糖分檢測的分子標記互助選擇。45氨基酸短肽為信號肽，亞細胞定位發(fā)現其可影響97103-835和PI296341-835蛋白定位：97103-835蛋白表達在質膜，而PI296341-835蛋白主要表達在內膜系統(tǒng)。RNA原位雜交顯示97103-835特異

11、性在高糖品種果實維管束系統(tǒng)表達，這表明97103-835可能是參與果實韌皮部糖分卸載，而非果肉細胞糖分裝載。
　　為明確高糖材料97103和低糖材料PI296341中835數千倍差異表達的機制，分析啟動子發(fā)現上游1187 bp存在一個MYC(bHLH) E-box（CANNTG）識別位點差異：CAAATG->CAAAGG。以此E-box位點為誘餌序列，篩選97103cDNA酵母單雜交文庫，發(fā)現位于QBRIX2-3的轉錄因子998可

12、結合該E-box元件。以煙草瞬時表達系統(tǒng)共表達998和835啟動子1700 bp啟動的Luc熒光素蛋白，結果顯示998能有效激活97103-835啟動子1700 bp，而不能激活PI296341-835啟動子1700 bp區(qū)域。充分證明該基因啟動子區(qū)域 E-box motif的 SNP改變導致了轉錄活性差異，從而明確QBRIX2-3對QBRIX2-1的轉錄調控機制。
　　4．QBRIX2-2區(qū)間糖轉運蛋白基因ClTST2的表達譜分

13、析、功能初析及調控因子。QBRIX2-2涉及20個候選基因，從蛋白功能注釋分析只有ClTST2屬于TMT家族糖轉運蛋白；轉錄組分析發(fā)現ClTST2在高糖材料97103果實成熟過程4個關鍵時期上調表達，而在低糖材料PI296341果實成熟4個關鍵時期下調表達，Q-PCR檢測約50份典型重測序材料ClTST2表達發(fā)現其表達量與含糖量正相關，故將轉運蛋白基因ClTST2確定為QBRIX2-2的候選基因。將目標基因轉入帶YFP的植物表達載體，轉

14、化西瓜果實原生質體，結果表明轉運蛋白ClTST2在西瓜液泡中表達。膜片鉗技術檢測表明ClTST2具有單糖（葡萄糖、果糖）和二糖（蔗糖）轉運功能；將ClTST2瞬時表達于草莓的白果期，表達3-4天后可以明顯觀察到ClTST2過表達草莓能夠較表達空載體的草莓積累1.5倍的糖分。酵母單雜交和EMSA結果表明WAKY家族ClSUSIBA2能有效結合ClTST2的W box和糖響應順式作用元件。煙草瞬時表達發(fā)現97103-pClTST2::LUC

15、和PI296341-FR-pClTST2::LUC均被ClSUSIBA2抑制表達。分析其表達模式發(fā)現ClTST2在低糖材料（組織）中被ClSUSIBA2抑制，而在高糖材料中，隨著果實成熟，不斷解除了其對ClTST2的抑制，使ClTST2表現出不斷升高的表達趨勢。
　　5．GWAS發(fā)現糖分積累相關基因ClSWT及其轉錄水平、功能解析。以130份重測序自然群體材料約100萬SNP數據進行全基因組關聯分析，在Chr1短臂末端378844

16、附近獲得了西瓜糖分含量SNP，該SNP位于ClSWT，與130份重測序自然群體糖分含量吻合度達86%。轉錄組分析發(fā)現，ClSWT在高糖材料97103果實成熟4個關鍵時期高量上調表達，而在低糖材料PI296341果實成熟4個關鍵時期無表達，Q-PCR檢測約50份典型重測序材料ClSWT表達發(fā)現其表達量與含糖量正相關，確定為候選基因。ClSWT轉化己糖吸收缺陷酵母菌種Ysl2-1后，能互補其果糖和葡萄糖吸收功能，證明其具有果糖和葡萄糖轉運能

17、力。
　　6．西瓜糖分積累機制網絡節(jié)點模式圖繪制。水蘇糖、棉籽糖是西瓜韌皮部運輸的主要糖分， 主要由α-半乳糖苷酶(AGA)將水蘇糖、棉籽糖分解為蔗糖，此為糖分果實卸載第一關鍵節(jié)點。韌皮部維管束中蔗糖被酸性轉化酶分解成果糖和葡萄糖后從韌皮部卸載，此為糖分運輸第二關鍵節(jié)點，可能由QBRIX2-1835參與協(xié)助，并由bHLH家族轉錄因子控制表達。糖分運輸第三關鍵節(jié)點為果肉細胞質膜上糖分運輸，為本研究已證明功能ClSWT控制。