甜橙糖轉(zhuǎn)運(yùn)子基因分離及其在果實(shí)糖積累中的功能研究.pdf

1、可溶性糖，主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖，是決定甜橙果實(shí)品質(zhì)的重要營(yíng)養(yǎng)成分。果實(shí)中積累的可溶性糖是在葉片中經(jīng)光合作用合成，并由維管束韌皮部運(yùn)輸而來。Sugar transporter是位于細(xì)胞膜或亞細(xì)胞器膜上跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖的載體蛋白，廣泛參與糖在源葉的韌皮部裝載，庫(kù)器官處的韌皮部卸載，庫(kù)組織細(xì)胞的糖吸收，和糖的跨液泡膜運(yùn)輸，從而調(diào)控植株的糖轉(zhuǎn)運(yùn)和積累。研究Sugar transporter基因?qū)μ接懱鸪鹊奶寝D(zhuǎn)運(yùn)與分配，調(diào)控果實(shí)糖積累具有重要意義

2、。本研究針對(duì)甜橙果實(shí)發(fā)育過程中的可溶性糖積累，結(jié)合基因系統(tǒng)進(jìn)化，表達(dá)分析，亞細(xì)胞定位，酵母功能互補(bǔ)，同位素標(biāo)記和熒光標(biāo)記等技術(shù)，分離甜橙Sugar transporter基因家族，研究其在果實(shí)糖積累中的功能，并探討相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。以期篩選出參與果實(shí)糖積累的關(guān)鍵基因，進(jìn)一步理解果實(shí)糖轉(zhuǎn)運(yùn)和積累機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)甜橙Sugar transporter基因家族克隆和表達(dá)分析
　　甜橙基因組中共分離77個(gè)Sugar

3、 transporter基因，編碼3個(gè)SUT，58個(gè)MST和16個(gè)SWEET轉(zhuǎn)運(yùn)子。甜橙3個(gè)SUT成員分別屬于SUT1，SUT2和SUT4類型。58個(gè)MST可分為7個(gè)亞族，其中STP和ERD6L亞族發(fā)生基因串聯(lián)復(fù)制，導(dǎo)致家族成員大規(guī)模增加。STP亞族成員響應(yīng)ABA和低溫的表達(dá)模式，反映其基因串聯(lián)復(fù)制可能與抵御逆境有關(guān)。大量Sugar transporter基因在葉片、花、果實(shí)和愈傷組織中表達(dá)，廣泛參與源和庫(kù)組織的糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在果實(shí)表達(dá)的

4、Sugar transporter基因，大部分隨果實(shí)糖積累過程上調(diào)表達(dá)，在果實(shí)糖積累中發(fā)揮重要作用。
　　(2)甜橙SUT家族功能鑒定和在‘紅暗柳'甜橙果實(shí)高蔗糖積累中的作用
　　酵母功能互補(bǔ)結(jié)果表明CsSUT1，CsSUT2和CsSUT4都具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。使用具有熒光的蔗糖類似物Esculin，證明CsSUT1是具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蔗糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)子，pH值為5.0時(shí)具有最大轉(zhuǎn)運(yùn)活性。C14標(biāo)記蔗糖檢測(cè)表明CsSUT4是蔗糖質(zhì)

5、子同向轉(zhuǎn)運(yùn)子，對(duì)蔗糖和麥芽糖特異運(yùn)輸，pH值為4.0時(shí)對(duì)蔗糖具有最大轉(zhuǎn)運(yùn)活性。解偶聯(lián)劑CCCP和細(xì)胞膜質(zhì)子泵抑制劑釩酸鹽明顯抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CsSUT4定位于液泡膜。從蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)和分配角度，對(duì)甜橙芽變‘紅暗柳'果實(shí)高糖積累機(jī)制進(jìn)行初步探討。和親本‘暗柳'相比，‘紅暗柳'果實(shí)積累更高含量的蔗糖，淀粉積累相應(yīng)減少。‘紅暗柳'源葉CsSUT1，CsSUT2和CsSUT4具有較高表達(dá)，促進(jìn)了蔗糖的韌皮部裝載。相應(yīng)地，‘紅暗柳'植

6、株韌皮部運(yùn)輸?shù)恼崽呛扛哂凇盗??！t暗柳'果實(shí)CsSUT2具有較高的表達(dá)，促進(jìn)了蔗糖在果實(shí)的韌皮部卸載。‘紅暗柳'果肉pH值達(dá)到5.8，遠(yuǎn)高于‘暗柳'的pH值3.8，表明‘紅暗柳'果實(shí)CsSUT4轉(zhuǎn)運(yùn)液泡蔗糖到胞質(zhì)的活性減弱，蔗糖較多積累在液泡。氧化逆境誘導(dǎo)CsSUT2表達(dá)，說明CsSUT2在‘紅暗柳'果實(shí)中的高表達(dá)可能與‘紅暗柳'果實(shí)遭受更強(qiáng)的氧化逆境有關(guān)。
　　(3)液泡葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子CsERD6L在果實(shí)糖積累中的功能與調(diào)控

7、機(jī)制
　　酵母功能互補(bǔ)表明在果實(shí)中表達(dá)的CsSTP13是葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)運(yùn)子，負(fù)責(zé)果實(shí)成熟期間質(zhì)外體單糖的吸收。并建立熒光標(biāo)記葡萄糖2NBDG檢測(cè)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的方法。克隆ERD6L亞家族的一個(gè)成員CsERD6L，在花中表達(dá)量最高，在源葉中微弱表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明CsERD6L蛋白定位于液泡膜。酵母功能互補(bǔ)檢測(cè)表明CsERD6L不能恢復(fù)酵母生長(zhǎng)。利用2NBDG檢測(cè)CsERD6L轉(zhuǎn)運(yùn)活性，去除可能的液泡定位序列的CsERD6L

8、具有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，其轉(zhuǎn)運(yùn)不依賴于pH值。超量表達(dá)CsERD6L的酵母細(xì)胞中葡萄糖含量降低，說明CsERD6L介導(dǎo)液泡葡萄糖向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。CsERD6L與液泡酸性轉(zhuǎn)化酶Csb Fruct1在果實(shí)成熟期間上調(diào)表達(dá)，負(fù)責(zé)將液泡內(nèi)蔗糖水解并運(yùn)輸至胞質(zhì)參與代謝活動(dòng)。通過果肉處理，CsERD6L啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)和檢索基因芯片數(shù)據(jù)，表明CsERD6L受ABA，氧化逆境處理和糖饑餓逆境誘導(dǎo)表達(dá)。利用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)探討了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CsER

9、D6L表達(dá)的研究，ASR類轉(zhuǎn)錄因子CsASR和一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子Cs8912680未轉(zhuǎn)錄激活CsERD6L表達(dá)。CsERD6L和CsbFruct1-2在芽變‘紅暗柳'果實(shí)高表達(dá)，說明‘紅暗柳'果實(shí)在遭受更強(qiáng)的氧化逆境下，液泡中積累的大量蔗糖，被較多水解為單糖后運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)。
　　綜上所述，本研究系統(tǒng)分離了甜橙糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族，驗(yàn)證了參與果實(shí)糖轉(zhuǎn)運(yùn)和積累的關(guān)鍵候選基因的功能，并探討了其調(diào)控模式。從糖轉(zhuǎn)運(yùn)的角度，探討了SUT家族在‘紅暗柳