鴨疫里默氏菌dnaK基因功能初析.pdf

1、鴨疫里默氏菌(RA)可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，引起一種急性敗血性或慢性傳染病，常給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經濟損失。為了研究RA的DnaK是否具有分子伴侶的基本特征，以及在熱脅迫等應激條件下是否發(fā)揮作用，本文進行了一系列的研究，獲得如下結果。
　　1、將本實驗室分離保存的RA野毒株RA-CH-1株dnaK、dnaJ和grpE全基因序列分別克隆到表達載體pET32a(+)載體中，構建原核表達質粒pET32a(+)dnaK、pET32a(

2、+)dnaJ和pET32a(+)grpE并將其分別轉入大腸桿菌BL21中，成功表達出DnaK、DnaJ和GrpE重組蛋白，用親和層析的方法獲得純度較高的重組蛋白。
　　2、用超微量ATP測試盒分別測定純化的重組蛋白DnaK、DnaJ和GrpE在K+/Na+或Mg2+/Ca2+環(huán)境中水解ATP的活性。結果顯示，重組蛋白DnaJ和GrpE不具有ATPase活性;而重組蛋白DnaK具有微弱的ATPase活性且DnaJ和GrpE可增強Dn

3、aK的ATPase活性，反應溫度50℃時DnaK的ATPase活性最高。
　　3、用純化的DnaK蛋白免疫小鼠制備鼠抗DnaK多克隆抗體，間接ELISA檢測血清效價達到1∶102400。Western blot檢測鼠抗DnaK與RA-CH-1全菌蛋白及純化的DnaK蛋白的反應性，結果顯示該抗體能特異性地識別RA的DnaK蛋白。
　　4、以不同應激條件處理RA-CH-1，提取RNA，熒光定量PCR檢測其dnaK的mRNA水平，

4、結果表明，當RA受到熱、H2O2、氨基糖苷類抗生素脅迫及滲透壓的作用時，其dnaK的轉錄水平顯著升高;受到酸堿脅迫時，dnaK的mRNA水平無明顯變化。
　　5、根據RA的DnaK與大腸桿菌的DnaK氨基酸序列一致性達60％以上，利用λred重組的方法獲得缺失了dnaK的大腸桿菌XL1-Blue△dnaK株，同時構建的RA DnaK原核表達載體pBAD24dnaK轉化XL1-Blue△dnaK獲得缺失回補株，在不同溫度的應激條件下

5、測定親本株E.coliXL1-Blue、缺失株E.coli XL1-Blue△dnaK和缺失回補株E.coliXL1-Blue△dnaK pBAD24dnaK的生長曲線，結果親本株E.coliXL1-Blue生長良好，缺失株E.coliXL1-Blue△dnaK在42℃時不生長，而回補了RA DnaK的E.coliXL1-Blue△dnaK pB AD24dnaK生長速率得到一定的恢復。表明RADnaK不僅能在一定程度上增強大腸桿菌XL