低氧通過HIF-1α調(diào)控髓核細(xì)胞中ADAMTS-4,-5的表達(dá).pdf

1、研究背景:下腰痛為臨床常見疾病。其發(fā)病率高，導(dǎo)致患者慢性疼痛的同時(shí)，還有較高致殘率，產(chǎn)生巨大的家庭、社會(huì)負(fù)擔(dān)，逐漸引起人們的高度關(guān)注。下腰痛的產(chǎn)生原因較多，目前公認(rèn)的主要原因?yàn)樽甸g盤退變。椎間盤是人體最大的無血管組織，生理狀態(tài)下僅于軟骨終板及外層的纖維環(huán)有少量血管分布。椎間盤內(nèi)氧分壓由外至內(nèi)落差較大，正常外層纖維環(huán)氧分壓約為7.5kPa，髓核組織內(nèi)氧分壓約為0.5kPa。生理狀態(tài)下，髓核組織處于低氧狀態(tài)。在退變椎間盤組織中，低氧環(huán)境因新

2、生血管的長(zhǎng)入受到破壞，髓核中心氧分壓可升高至1.04-12.67kPa。已有研究證實(shí)，低氧狀態(tài)下髓核中Ⅱ型膠原、蛋白聚糖含量升高，Ⅰ型膠原含量下降，常氧環(huán)境下相反。低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia Inducible Factor，以下簡(jiǎn)稱為HIF）廣泛存在于慢性缺氧細(xì)胞中，是細(xì)胞在低氧狀態(tài)下進(jìn)行各種代謝、調(diào)節(jié)活動(dòng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，分為3種亞型，其中，HIF-1在低氧組織中起主要作用，在低氧狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)，其生物活性主要由HIF-1α決定。<

3、br>　　解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)家族對(duì)椎間盤退變過程有顯著影響，ADAMTS-4和ADAMTS-5是ADAMTS家族中的兩種關(guān)鍵降解酶，作用方式為徹底水解聚蛋白聚糖，破壞細(xì)胞外基質(zhì)成分的完整性，在椎間盤退變過程中起關(guān)鍵作用，是目前公認(rèn)的最為重要聚蛋白聚糖（Aggrecan）降解酶。已有研究證實(shí)，低氧和ADAMTS-4，ADAMTS-5分別對(duì)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的成分、代謝及穩(wěn)定具有重要調(diào)節(jié)作用，但是對(duì)于二者間的關(guān)系及具體作用機(jī)制

4、未闡明。
　　研究目的:通過觀察低氧環(huán)境以及其所誘導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5在髓核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控作用，研究分析HIF-1α在髓核細(xì)胞中對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其在椎間盤退變中的作用靶點(diǎn)等具體機(jī)制，為椎間盤退變生物療法的開展提供思路借鑒。
　　研究方法:體外培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞，分別使用常氧和低氧培養(yǎng)箱(1％O2，5％CO2，94％N2)進(jìn)行干預(yù)，用實(shí)時(shí)熒光定量聚

5、合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)不同干預(yù)條件下，大鼠髓核細(xì)胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5在mRNA水平的差異，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同干預(yù)條件下，大鼠髓核細(xì)胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5在蛋白水平的差異。構(gòu)建人PGL3-ADAMTS-4和PGL3-ADAMTS-5質(zhì)粒，使用上述質(zhì)粒分別與不同表達(dá)程度HIF-1α質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)HIF-1α對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5啟動(dòng)子活性的影響。使用J

6、ASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)分析ADAMTS-4，ADAMTS-5啟動(dòng)子片段中可能的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)。
　　研究結(jié)果:qPCR和Western blot結(jié)果顯示，低氧可在mRNA和蛋白水平抑制髓核細(xì)胞中ADAMTS-4，ADAMTS-5的表達(dá)。使用JASPAR軟件分析發(fā)現(xiàn)ADAMTS-4啟動(dòng)子中可能包含1個(gè)HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)，而ADAMTS-5啟動(dòng)子中可能包含2個(gè)HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示，HIF-1α

7、對(duì)ADAMTS-4，ADAMTS-5啟動(dòng)子活性有明顯抑制作用，且該抑制作用與HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒的劑量呈正相關(guān)性。DN-HIF-1α(Dominant Negative，顯性負(fù)突變)能夠拮抗低氧對(duì)ADAMTS-4，ADAMTS-5啟動(dòng)子活性的抑制作用。
　　研究結(jié)論:低氧可通過HIF-1α抑制ADAMTS-4，ADAMTS-5的表達(dá)，對(duì)髓核中聚蛋白聚糖的含量進(jìn)行調(diào)控，從而保持椎間盤內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)態(tài)。因此，推斷HIF-1α可能可以作為