強(qiáng)心苷類藥物抑制低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：最近研究表明，強(qiáng)心苷類藥物除可應(yīng)用于治療心血管疾病，還可預(yù)防與治療腫瘤，且其抗腫瘤作用可能與抑制低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白表達(dá)密切關(guān)系，但強(qiáng)心苷類藥物如何調(diào)節(jié)HIF-1α蛋白的分子機(jī)制尚未闡明。本課題探討強(qiáng)心苷類藥物抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的分子靶點(diǎn)，為臨床上強(qiáng)心苷類藥物合理應(yīng)用治療腫瘤提供科學(xué)依據(jù)，也為設(shè)計(jì)HIF-1α蛋白抑制劑提供新思路。
　　 方法：(1)Western Blot法和TR-PCR法分別檢測(cè)強(qiáng)心苷類藥

2、物作用后相關(guān)蛋白表達(dá)和mRNA水平的變化；(2)運(yùn)用siRNA技術(shù)分別對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)eIF-20α，Na+/K+-ATPase和eIF4E基因進(jìn)行沉默，檢測(cè)基因沉默后強(qiáng)心苷類藥物對(duì)HIF-1α蛋白水平影響的變化；(3)運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，過表達(dá)eIF4E蛋白，檢測(cè)強(qiáng)心苷類藥物對(duì)HIF-1α蛋白水平影響的變化；(4)計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模型預(yù)測(cè)強(qiáng)心苷類藥物與蛋白翻譯相關(guān)因子的結(jié)合能量參數(shù)；(5)采用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞體外翻譯體系，檢測(cè)強(qiáng)心苷類藥物在體外對(duì)

3、蛋白質(zhì)翻譯影響的變化；(6)采用改良的兩套報(bào)告基因體系，評(píng)價(jià)強(qiáng)心苷類藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)“帽”(cap)依賴性蛋白質(zhì)翻譯的影響；(7)運(yùn)用免疫沉淀法檢測(cè)藥物作用后，eIF4E與HIF-1α mRNA、eIF4G蛋白結(jié)合水平的變化；(8)采用sRB染色法評(píng)價(jià)eIF4E在Ouabain抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1強(qiáng)心苷類藥物可抑制低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白表達(dá)選取不同來源腫瘤細(xì)胞(OVCAR8，AGS，HeP

4、G2，Hela，U2OS)，在低氧下用Ouabain(100，200，400，800nM)處理細(xì)胞8小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示，在各細(xì)胞株中Ouabain對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的減少呈現(xiàn)濃度依賴性；此外，Ouabain能下調(diào)氯化鈷引起的HIF-1α蛋白表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性；強(qiáng)心苷類藥物ProscillaridinA也能有效地下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)，且有效濃度低于Ouabain。而Digitonin在濃度為1μM范圍內(nèi)不

5、能下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　 2強(qiáng)心苷類藥物可減少HIF-1α蛋白合成從而影響其蛋白表達(dá)
　　 熒光定量PCR及半定量PCR結(jié)果顯示，U2OS細(xì)胞經(jīng)Ouabain作用后，HIF-1αmRNA水平無顯著性變化；Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在U2OS細(xì)胞中Ouabain并未加速HIF-1α蛋白的降解；蛋白酶體抑制劑MG132未逆轉(zhuǎn)Ouabain引起的HIF-1α蛋白下調(diào)。上述結(jié)果提示Ouabain抑制HIF

6、-1α蛋白的表達(dá)可能是由于減少HIF-1α蛋白的合成。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，強(qiáng)心苷類藥物Ouabain(100 nM)和ProscillaridinA(50 nM)能有效地抑制HIF-1α蛋白合成。
　　 3 mTORC1、eIF2α和Na+/K+ATPase并不參與強(qiáng)心苷類藥物抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的過程
　　 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，U2OS細(xì)胞經(jīng)Ouabain作用后，Ouabain對(duì)mTOR、4E-B

7、P1的原型及其磷酸化水平均無明顯變化，提示mTORC1/4E-BP1信號(hào)通路在這一過程中未發(fā)揮重要作用；雖然強(qiáng)心苷類藥物作用后eIF2α磷酸化水平明顯上升，但沒有抑制HIF-1α蛋白表達(dá)作用的Digitonin同樣地也能上調(diào)eIF2α的磷酸化水平。此外，用siRNA沉默eIF2α后并未觀察到有逆轉(zhuǎn)強(qiáng)心苷類藥物對(duì)HIF-1α抑制的作用，提示eIF2α信號(hào)通路也未在這一過程中發(fā)揮重要作用；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，siRNA沉默Na+/K+-ATPa

8、se對(duì)強(qiáng)心苷類藥物引起HIF-1α下調(diào)作用無影響，卻能上調(diào)eIF2α磷酸化水平，但在Na+/K+-ATPase基因敲除后Ouabain并未明顯地引起eIF2α磷酸化水平上調(diào)，表明強(qiáng)心苷類藥物激活eIF2α信號(hào)通路可能是由于抑制Na+/K+-ATPase的活性所導(dǎo)致的，進(jìn)一步證實(shí)eIF2α信號(hào)通路不參與強(qiáng)心苷類藥物抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的過程中。
　　 4強(qiáng)心苷類藥物抑制“帽”依賴性蛋白質(zhì)翻譯過程
　　 應(yīng)用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞

9、裂解液體外翻譯體系，發(fā)現(xiàn)Ouabain較好地抑制蛋白質(zhì)翻譯過程；根據(jù)計(jì)算機(jī)分子擬合結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷類藥物與真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4E有較好的相互作用。我們采用改良的兩套蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控體系來研究強(qiáng)心苷類藥物對(duì)eIF4E調(diào)控的“帽”依賴性蛋白質(zhì)翻譯的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ouabain能抑制eIF4E調(diào)控的“帽”依賴性蛋白質(zhì)翻譯，對(duì)“帽”非依賴性蛋白質(zhì)翻譯無影響；此外，我們還觀察到Ouabain能在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制Cyclin D1蛋白的表

10、達(dá)，進(jìn)一步明確Ouabain能較好地抑制eIF4E的活性。
　　 5 eIF4E在強(qiáng)心苷類藥物抑制HIF-1α蛋白表達(dá)中的作用
　　 在前列腺癌(DU145)，骨肉瘤(U2OS)，肝癌(HepG2和SMMC-7721)，肺癌(A549和95D)，卵巢癌(SKOV3)和宮頸癌(HeLa)等8株細(xì)胞株中，我們發(fā)現(xiàn)eIF4E蛋白與HIF-1α蛋白表達(dá)存在著較好的正相關(guān)性(R=0.882，P=0.004)；在U2OS細(xì)胞中將eI

11、F4E沉默后，HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯下降，而過表達(dá)eIF4E，結(jié)果則相反，即HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；此后，考察eIF4E在強(qiáng)心苷類藥物抑制HIF-1α蛋白表達(dá)中的作用，發(fā)現(xiàn)eIF4E沉默后可逆轉(zhuǎn)強(qiáng)心苷類藥物Ouabain和Proscillaridin A所引起HIF-1α蛋白表達(dá)的下調(diào)，而外源性過表達(dá)的eIF4E能減弱強(qiáng)心苷類藥物Ouabain和Proscillaridin A對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的抑制作用，并呈濃度依

12、賴性。這些結(jié)果說明強(qiáng)心苷類藥物可能通過抑制eIF4E的活性來抑制HIF-1α蛋白表達(dá)；免疫沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心苷類藥物不是通過阻斷eIF4E和HIF-1αmRNA之間的結(jié)合，而是通過阻斷eIF4E/eIF4G之間的結(jié)合來抑制eIF4E的功能從而發(fā)揮其抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的作用。此外，過表達(dá)eIF4E能減弱強(qiáng)心苷類藥物Ouabain對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。
　　 結(jié)論：本文對(duì)強(qiáng)心苷類藥物抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的作用及對(duì)其作用機(jī)

13、制進(jìn)行了深入的研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心苷類藥物Ouabain和Proscillaridin A能不同程度地抑制細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)；這種抑制作用不是通過阻斷mTOR，eIF2a和Na+/K+-ATPase這些信號(hào)通路，更不是阻斷eIF4E和底物mRNA之間的結(jié)合所致，而是通過阻斷eIF4E/eIF4G之間的結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物eIF4F的形成所導(dǎo)致的。本課題研究強(qiáng)心苷類藥物抑制低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α蛋白表達(dá)的作用及其分子