腎小管上皮細胞中HIF-1α對MICA調控作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 人類主要組織相容性復合體Ⅰ相關基因A(MICA)在固有免疫和適應性免疫中發(fā)揮重要作用。越來越多的臨床研究表明，腎移植受者血清中抗MICA抗體的含量與移植后急性和慢性排斥反應發(fā)生率密切相關，但目前其激活和作用機制仍不清楚。有研究發(fā)現，缺血再灌注（I/R）損傷可以上調小鼠腎臟中MICA表達，而低氧誘導因子-1(HIF-1)表達增加作為缺血早期首發(fā)的分子水平適應性反應，能通過調控下游系列基因表達，介導與缺氧相關

2、的各種生理性反應。有研究發(fā)現人原代心肌細胞中，HIF-1α過表達能上調MICA表達。因此推測人腎小管上皮細胞也可能存在類似激活作用機制。因此，本研究的目的在于初步探討人腎小管上皮細胞中HIF-1α過表達是否可增強細胞MICA基因表達。
　　 方法:
　　 1.進行腎小管上皮細胞系培養(yǎng)，摸索建立體外缺血再灌注模型，確定在2％氧濃度下缺氧18h后正常供氧。
　　 2.進行重組腺病毒的擴增、純化，采用組織培養(yǎng)感染劑量法

3、(tissuecultureinfectionsdose，TCID法)進行病毒滴度的測定。
　　 3.轉染在常氧下可以穩(wěn)定表達并發(fā)揮正常功能的HIF-1α重組腺病毒(Ad.CMV.HIF-1α△ODD)，在轉染的24、28、72、96h后用TRIZOL提取HK-2的總RNA并進行反轉錄PCR。采用標準曲線法，以B-ACTIN作為內參因，通過熒光定量PCR檢測HIF-1α、HO-1、VEGF和MICA的基因轉錄水平。在腺病毒轉染的

4、96h用免疫熒光的方法檢測目的基因HIF-1α在HK-2中蛋白水平的表達情況。
　　 4.體外用缺氧再給氧（H/R）模型模擬I/R，HIF-1α基因沉默后，將經過RNAi處理過的細胞在2％氧濃度下培養(yǎng)18h進行缺氧后，在缺氧再給氧的0h、4h、8h和16h收集細胞。用TRIZOL法提取HK-2細胞的總RNA并進行反轉錄PCR。同時以基因β-ACTIN作為內參，通過熒光定量的方法檢測HIF-1α和MICA基因的轉錄水平。
　

5、　 5.實驗數據均用均數±標準差((x)±S)來表示。兩組均數間的比較采用t檢驗，使用SPSS13.0統計軟件進行計算，P＜0.05認為有顯著性差異。
　　 結果:
　　 1.在常氧條件下，HIF-1α的過表達可以上調細胞MICA基因蛋白的表達。Ad.CMV.HIF-1α△ODD組和Ad.CMV.HIF-1α組的HIF-1αmRNA水平從轉染的24h后就開始升高，在72h達到高峰，96h有略微的下降;并且兩組間mRNA

6、水平差異不大，在HIF-1α基因的轉錄水平上表達相似。而Ad.CMV.LacZ組和非轉基因組的HIF-1αmRNA水平相比前兩組一直保持很低水平，并且基本無變化。免疫熒光結果顯示，在轉染的96h后，Ad.CMV.HIF-1α△ODD組的HIF-1α蛋白的表達較正常組顯著增加，而Ad.CMV.HIF-1α組中僅檢測到少量HIF-1α的表達;而Ad.CMV.LacZ組和非轉基因組中均未檢測到HIF-1α蛋白的表達，提示在常氧狀態(tài)下，改造后的

7、HIF-1α△ODD較HIF-1α的蛋白表達更為穩(wěn)定，不受氧依賴性的降解。
　　 2.常氧狀態(tài)下，Ad.CMV.LacZ組合和非轉基因的MICAmRNA水平一直基本無變化，提示一般的腺病毒感染不會啟動MICA基因的轉錄，而Ad.CMV.HIF-1α△ODD組的MICAmRNA水平在轉染后的48h較前兩組有明顯的升高，并在96h達到對照組的三倍。Ad.CMV.HIF-1α組的MICAmRNA水平在轉染后的72h較對照組有明顯升高，

8、大約是對照組的兩倍，但一直明顯低于Ad.CMV.HIF-1α△ODD組。提示常氧狀態(tài)下，HIF-1α的表達可以上調MICA基因的轉錄水平。
　　 3.在缺氧再給氧的0h時，缺氧組的HK-2細胞中HIF-1αmRNA的轉錄水平相比正常條件下培養(yǎng)的對照組上調明顯，并在4h時持續(xù)升高，在在8h開始下降，16h后即恢復至正常培養(yǎng)條件下的對照組水平。而在HIF-1αsiRNA處理組中，0-16h內HIF-1α的mRNA表達水平和對照組一直

9、沒有明顯的變化和差異，說明對HIF-1α轉錄水平的沉默抑制效果明顯;并且陰性對照siRNA處理組中的HIF-1αmRNA的變化情況同缺氧組基本一致，說明轉染siRNA本身不能抑制HIF-1αmRNA的轉錄上調。免疫熒光的結果也顯示，在缺氧再給氧的0h時，在缺氧組和陰性siRNA處理組中檢測到明顯的HIF-1α蛋白表達，而HIF-1αsiRNA處理組和正常培養(yǎng)條件下的對照組中則幾乎檢測不到HIF-1α蛋白的表達。
　　 4.在缺氧

10、再給氧的0h時，缺氧組的HK-2細胞中MICAmRNA的轉錄水平相比正常條件下培養(yǎng)的對照組上調明顯，并在4h時持續(xù)升高，在8h開始下降，16h后即恢復至正常培養(yǎng)條件下的對照組水平，該表達變化趨勢和HIF-1α基因基本一致。而在HIF-1αsiRNA處理組中，0-16h內MICA的mRNA表達水平和正常條件下培養(yǎng)的對照組一直沒有明顯的變化和差異，說明缺氧再給氧過程中對HIF-1α基因的抑制明顯導致了MICA轉錄水平的下調;另一方面，因為陰