新型抗真菌先導(dǎo)物的設(shè)計(jì)、合成和生物活性研究.pdf

1、近年來(lái)，侵襲性真菌感染(Invasive Fungal Infections，IFIs)的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，臨床上真菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，而用于治療深部真菌感染的藥物存在毒副作用大、抗菌譜窄、易產(chǎn)生耐藥等諸多不足，因此，發(fā)現(xiàn)全新結(jié)構(gòu)類型和作用機(jī)制的先導(dǎo)化合物成為抗真菌藥物研究的重要方向。
　　目前，抗真菌藥物研發(fā)主要有以下策略：(1)現(xiàn)有抗真菌藥物的優(yōu)化和改進(jìn);(2)發(fā)現(xiàn)抗真菌新靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)特異性的抑制劑;(3)基于表型

2、篩選的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)和靶標(biāo)確證。對(duì)現(xiàn)有藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改進(jìn)難以避免其固有作用機(jī)制帶來(lái)的缺陷。因此，本文基于抗真菌新靶點(diǎn)Pdr1-Gal11A KIX蛋白，設(shè)計(jì)合成了兩類全新結(jié)構(gòu)的抗真菌先導(dǎo)化合物，并針對(duì)課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的咔啉類先導(dǎo)化合物進(jìn)行深入的抗真菌作用機(jī)制研究。
　　一、基于Pdr1-KIX相互作用的抗真菌先導(dǎo)物的設(shè)計(jì)、合成和活性研究
　　本研究基于Pdr1-Gal11A KIX蛋白-蛋白相互作用，以抑制劑iKIX1

3、為先導(dǎo)化合物，通過(guò)分析iKIX1與KIX蛋白的氫鍵作用模式圖，設(shè)計(jì)、合成了19個(gè)肼硫代甲酰胺類衍生物。通過(guò)體外抗真菌活性測(cè)試，確證iKIX1對(duì)于光滑念珠菌有中等抑制活性(MIC50=1μg/mL)。構(gòu)效關(guān)系表明，硫脲結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮活性的關(guān)鍵基團(tuán)，將硫脲結(jié)構(gòu)中的硫原子替換為氧原子活性喪失，骨架苯環(huán)上引入供電基、芳環(huán)、芳雜環(huán)均不能提高活性。但是，苯環(huán)上硝基取代的化合物5q、乙炔基取代的化合物12a對(duì)光滑念珠菌和新生隱球菌的抑制活性均優(yōu)于先導(dǎo)化

4、合物iKIX1，與陽(yáng)性對(duì)照藥氟康唑相當(dāng)。采用秀麗隱桿線蟲真菌感染模型進(jìn)行初步的體內(nèi)抗真菌藥效研究，結(jié)果表明，化合物5q、12a能在一定程度上延長(zhǎng)線蟲的生存期。
　　二、吡唑硫代酰胺類新型抗真菌先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化和活性研究
　　在對(duì)IKIX1進(jìn)行合成的過(guò)程中，意外分離得到一個(gè)副產(chǎn)物7a，經(jīng)核磁、質(zhì)譜鑒定，確定該化合物結(jié)構(gòu)為5-氧代-2，5-二氫-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺。經(jīng)體外抗真菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其對(duì)三種常見致病真菌均具有優(yōu)

5、秀的體外抗真菌活性(MIC值為0.016-0.25μg/mL)，是一個(gè)全新抗真菌分子骨架。本研究以7a為先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行三個(gè)方面的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。首先，對(duì)5-氧代-1，2-吡唑酮環(huán)進(jìn)行骨架躍遷，用變構(gòu)的3-氧代-1，2-吡唑酮環(huán)替換，并在環(huán)上引入乙酰基;其次，對(duì)骨架苯環(huán)進(jìn)行取代基優(yōu)化，引入鹵素、烷基、芳香環(huán)等取代基;最后，在化合物7a雜環(huán)上引入疏水性基團(tuán)苯環(huán)。
　　經(jīng)體外抗真菌活性測(cè)試，優(yōu)選得到抗真菌活性最好的化合物7a、6d和11

6、a，并進(jìn)行初步作用機(jī)制研究和的體內(nèi)抗真菌藥效考查。
　　結(jié)果表明，化合物7a、6d和11a可以抑制真菌被膜形成，可以有效延長(zhǎng)新生隱球菌感染線蟲的生存期。此外，化合物7a可以濃度依賴地抑制新生隱球菌生長(zhǎng)，且明顯優(yōu)于氟康唑;在小鼠系統(tǒng)性感染模型中，化合物7a對(duì)新生隱球菌感染小鼠表現(xiàn)出一定的體內(nèi)抗真菌活性。
　　三、咔啉類化合物的抗真菌活性和作用機(jī)制研究
　　課題組前期通過(guò)表型篩選、結(jié)構(gòu)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了具有優(yōu)秀抗隱球菌活性的咔啉

7、類化合物JYJ-19和JYJ-20（MIC值為0.25-1μg/mL），但該類化合物的體內(nèi)抗真菌活性、作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)并不明確。本研究建立了小鼠系統(tǒng)性隱球菌感染模型，對(duì)該類化合物的體內(nèi)藥效進(jìn)行考察;對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，考察化合物對(duì)真菌增殖、生物被膜、黑素、尿素酶形成、細(xì)胞表面疏水性等新生隱球菌毒力因子的抑制作用，考察化合物作用下真菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和對(duì)細(xì)胞周期的影響。根據(jù)研究結(jié)果，進(jìn)一步考察化合物可能的作用通路。體內(nèi)活性測(cè)試結(jié)果表

8、明，化合物JYJ-19可以顯著提高系統(tǒng)性新生隱球菌感染小鼠的生存期。作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物JYJ-19和JYJ-20呈濃度依賴地抑制真菌細(xì)胞的增殖，對(duì)黑素、被膜和細(xì)胞表面疏水性有較好的抑制作用。透射電鏡結(jié)果顯示，在化合物JYJ-19作用下，真菌細(xì)胞核固縮、染色體凝集、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁均受損，與對(duì)照藥氟康唑作用下的損傷結(jié)果不同;細(xì)胞周期結(jié)果表明，JYJ-19阻滯真菌細(xì)胞于G2期，而氟康唑阻滯真菌細(xì)胞于G1期。以上結(jié)果提示該類化合物可能